研究背景:本研究是北京市自然基金(编号:7162117)的部分研究内容,并得到了北京中医药大学自主选题项目(2016-JYB-XS-129)的资助,旨在探讨基于肠道嘌呤核苷转运蛋白CNT2中药菊苣防治高尿酸血症作用机制的部分实验研究内容。高嘌呤饮食一直被认为是高尿酸血症的危险因素之一,高嘌呤饮食的摄入与高尿酸血症的发生发展密切相关。CNT2是肠道嘌呤核苷吸收的核心转运载体,抑制CNT2活性减少肠道嘌呤核苷的摄入可以降低血尿酸水平,有望成为药物干预新靶点。中药可以安全、有效的通过多途径、多靶点防治高尿酸血症,其能否通过干预肠道CNT2减少嘌呤的吸收从而降低体内尿酸水平有待探讨。因此,本研究以肠道CNT2为靶点,探讨中药减少肠道嘌呤吸收降尿酸的作用机制,为研究中药防治高尿酸血症的效用新靶点提供参考,具有明确的学术价值和临床现实意义。课题组前期研究发现,菊苣降尿酸效果显著,可以通过干预尿酸生成和排泄等环节降低血尿酸水平。实验室前期已从多个角度阐明菊苣防治高尿酸血症的药效机制。本课题切入肠道嘌呤核苷转运蛋白(CNT2),采用同源建模和分子对接技术虚拟筛选菊苣与肠道CNT2结合的化学成分,结合生物学实验验证菊苣化学成分对肠道CNT2的抑制作用,以期从减少肠道嘌呤核苷吸收的角度阐明菊苣降尿酸的作用机制,为研究中药防治高尿酸血症的作用靶点提供参考,同时为研究中药降尿酸的作用机制提供方法学参考。研究目的:1.分子对接虚拟筛选菊苣中与肠道CNT2转运蛋白相结合的化学成分,为进一步探讨菊苣干预肠道嘌呤转运蛋白降尿酸的作用机制提供理论依据2.生物学验证菊苣化学成分对肠道CNT2活性的抑制作用,阐明菊苣减少肠道嘌呤吸收环节降尿酸的作用机制,为中药防治高尿酸血症的效用新靶点提供参考。研究内容与方法本论文紧密围绕基于分子对接技术菊苣抑制嘌呤核苷吸收的降尿酸作用机制展开文献研究与实验研究。(一)文献综述文献研究主要通过检索国内外研究文献从肠道嘌呤核苷转运蛋白与高尿酸血症的关系、同源建模在中药研究中的应用和药物膜转运体研究中细胞模型的应用三个方面内容,为同源建模构建肠道CNT2蛋白结构,虚拟筛选菊苣与CNT2结合的化学成分,细胞实验验证菊苣单体成分对CNT2的抑制作用提供理论与方法基础。(二)实验研究实验研究主要分为两个章节第一章菊苣结合CNT2的化学成分虚拟筛选1.以实验室前期建立的菊苣小分子化学成分库为基础,以肠道嘌呤核苷转运蛋白为靶点,采用同源建模方法构建人源肠道CNT2蛋白的三维结构模型,已知活性抑制剂进行分子对接验证模型的可靠性,为后续虚拟筛选菊苣成分提供靶点CNT2的三维结构。2.分子对接技术虚拟筛选菊苣与嘌呤核苷转运蛋白结合的小分子化合物,并分析其与转运蛋白的作用结合模式,为从干预外源性嘌呤核苷摄入角度初步探讨中药菊苣降尿酸作用机制提供理论依据。第二章菊苣成分抑制CNT2活性的实验研究1.建立IEC-6单层细胞模型,通过观察细胞形态学、测定细胞单层跨上皮电阻、荧光素钠透过率等指标评价本实验室条件下建立的IEC-6单层细胞模型的可靠性。2.复制IEC-6单层细胞模型,在第一章实验筛选出的菊苣成分基础上,重点优先选择菊苣中含量高、专属性相对强的代表性成分探讨其对CNT2转运活性的抑制作用。在CNT2抑制剂、菊苣代表性命中成分干预下,采用高效液相法检测IEC-6细胞单层模型基底层CNT2转运底物腺苷的含量,观察菊苣单体化合物对CNT2的抑制作用,阐明菊苣减少肠道嘌呤核苷吸收的降尿酸作用机制。3.建立鹌鹑肠囊外翻模型,考察鹌鹑肠囊活性、培养时间、不同肠段CNT2转运底物量及最佳底物浓度,为验证菊苣单体成分对鹌鹑肠道CNT2活性的抑制作用提供可靠的模型。研究结果1.同源建模方法构建的肠道hCNT2三维结构合理和可靠,在一定范围内对不同活性的抑制剂具有一定的识别作用。2.以hCNT2模建模型为受体,以菊苣小分子化合物为配体,以阳性药(7,8,3’-三羟基黄酮)的打分为阈值,筛选出21个得分高于阳性药(打分阈值-8.0)的菊苣化合物。得分排名前十的化合物与hCNT2模建模型的作用模式以氢键和疏水作用为主。3.建立HPLC-UV测定培养液中腺苷含量的含量测定方法,以茶碱为内标,以甲醇-水为流动相,梯度洗脱,方法专属性良好,在0.7875-2.1 u g/ml的线性范围内,R2=0.9936测定方法的加样回收率均值在80%以上,精密度、重复性和稳定性RSD值均在10%以内,符合要求。4.建立了 IEC-6单层细胞模型,利用IEC-6细胞模型观察菊苣命中的代表性化学成分菊苣酸和山莴苣苦素对CNT2转运活性的影响,菊苣酸可以显著抑制CNT2对底物腺苷的转运(P<0.05)。研究结论:1.菊苣中含有与肠道CNT2相结合的化学成分,肠道CNT2可能是菊苣发挥降尿酸作用的靶点之一。2.菊苣中含有抑制肠道CNT2转运活性的化学成分,抑制肠道CNT2的活性减少肠道嘌呤吸收可能是菊苣发挥降尿酸的作用机制之一。