论文部分内容阅读
目的:结核病(Tuberculosis,TB)是危害人类呼吸道传染病之一,其致病菌-结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在进入肺部后被肺泡内细胞所吞噬,由宿主的第一道防线吞噬细胞如巨噬细胞所识别,MTB可以通过抑制凋亡、抑制吞噬体溶酶体融合、干扰信号转导、抑制ROS(Reactive Oxygen Species)和RNS(Reactive Nitrogen Species)毒性反应、抑制自噬等参与MTB抵抗宿主细胞免疫杀伤的过程。miR-29a-3p在MTB侵染巨噬细胞后表达发生不同程度上调,本研究以RAW264.7细胞为研究对象,通过检测转染pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体后细胞凋亡的变化情况,探讨miR-29a-3p在巨噬细胞抗MTB感染机制中的关键作用,为结核病的诊断与治疗提供新途径。方法:本研究通过Target Scan、miRDB、PicTar生物信息学软件查找miR-29a-3p靶基因,并运用DAVID生物信息学软件进行基因功能分析寻找关键靶基因为caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1。通过pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体转染巨噬细胞,以qRT-PCR方法初步研究miR-29a-3p及靶基因的表达水平变化情况,流式细胞术测定细胞凋亡率,酶活力测定caspase3、8变化,寻找miR-29a-3p对巨噬细胞免疫杀伤功能的影响的关键靶基因。结果:1.成功获得抑制载体,并对转染条件进行优化,确定当载体与EndoFectinTM-Max转染试剂的比为1:5时,转染后6h时换为完全培养基,转染的效率最佳。2.pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体转染巨噬细胞后miR-29a-3p表达量降低.3.pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体转染巨噬细胞后靶基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1及关键基因Bax均发生不同程度上调,为促凋亡作用。4.流式细胞术检测,巨噬细胞转染pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体后,与对照相比,凋亡率增高,且36小时凋亡率最高(P<0.05)。5.pEZX-AM02-miR-29a-3p抑制载体转染巨噬细胞后caspase-3,caspase-8酶活性升高,变化不显著。结论:抑制miR-29a-3p表达后miR-29a-3p调节靶基因caspase3、caspase7、caspase8、Bcl-2、Mcl-1及关键基因Bax使细胞凋亡作用增加,miR-29a-3p在巨噬细胞感染MTB后是抑制凋亡的,以逃避宿主细胞的免疫杀伤作用。