本课题选用Cre-lox系统进行目的基因的敲除,首先进行了植物乳杆菌WCFS1染色体上bsh基因的敲除。成功构建了携带bsh基因上下游约1kb大小的同源臂的敲除质粒pXU003;随后对质粒电转化植物乳杆菌的条件进行系统研究,从感受态细胞制备方法、质粒浓度、电压、细胞复苏时间四个方面进行优化,确立了最佳电转化条件为:选用PEG法制备感受态细胞、质粒用量为TB法提取的质粒4μL(质粒浓度约为1.6μg/μL)、电转化电压2200V、细胞复苏时间2h。该研究显著提高了质粒向植物乳杆菌转化的转化效率,解决了基因敲除时同源重组率低的难题。WCFS1基因组上的bsh基因的成功敲除,为本课题glmS基因在植物乳杆菌染色体上的顺利敲除提供有利条件。在此基础上,本课题通过构建glmS基因敲除质粒pXU004,成功敲除了植物乳杆菌WCFS1中的glmS基因,并且利用Cre-lox系统移除了插入的抗性筛选标记,获得的WCFS1-△glmS菌株作为构建乳酸菌食品级表达系统的一个必备条件。随后,本课题构建了携带his-tag标签的表达质粒pHIS460,并开展了 glmS基因的重组表达,Western-blot鉴定结果显示重组的GlmS-His蛋白成功表达,这是构建乳酸菌食品级表达系统的另一个必备条件。综上所述,本课题为构建基于glmS基因筛选标记的植物乳杆菌WCFS1的表达系统提供有利条件,也为更多乳酸菌食品级表达系统的构建提供理论依据。