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木茼篙(Argyranthemum)是菊科木茼蒿属多年生草本植株。木茼篙品种繁多,野生材料以白色品种居多,而商品生产以粉色和黄色品种为主。种质资源的保存是传统杂交育种和生物技术育种的前提条件。超低温保存是目前保存种质资源最理想的方法,因此建立木茼篙的超低温保存技术具有重要意义。菊花矮化类病毒(CSVd)是影响木茼篙生产的重要病害,严重影响木茼篙生产的持续发展;同时CSVd被国际上列为检疫性病害,限制了木茼篙资源与新品种在国家与地区间的交流。栽培无毒苗是目前防治植物类病毒的有效方法,生产无毒苗是无毒栽培的核心技术。本研究的主要内容包括:(1)建立木茼蒿茎尖超低温保存技术及超低温保存再生植株的遗传稳定性鉴定与温室生长评价;(2)多种方法脱除木茼蒿菊花矮化类病毒的效应研究;(3)揭示多种方法脱除菊花矮化类病毒的机理;(4)探究菊花矮化类病毒侵染不同木茼篙基因型茎尖差异的原因。获得的主要研究结果如下:1.从温室栽培的木茼篙品种‘Yellow Empire’取单芽茎段(0.5cm),经70%的乙醇和1%的次氯酸钠进行表面消毒,建立组织培养材料。通过培养基筛选,确立最佳试管苗快繁培养基为MS培养基中添加0.1mg/L NAA,1.0mg/L BAP,0.3mg/L GA3,3%蔗糖和0.6%琼脂。通过优化影响超低温保存的关键因素,建立了木茼篙茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系:从5周苗龄的试管苗取2.5 mm(含5-6片叶原基)的茎尖,在0.5M蔗糖预培养基上过夜,用含有2M甘油和0.4M蔗糖的加载液处理20分钟后,转移到植物玻璃化溶液PVS2中,0 oC条件下处理30 min,然后将茎尖转移到载有PVS2小滴(2.5μl)的铝箔条(2 cm x 0.8 mm)上,直接置于液氮中保存。超低温保存后的茎尖用含有1.2 M的蔗糖溶液室温解冻20 min后,移入含有0.05mg/L GA3的MS后培养基中再生成苗。超低温保存的茎尖后培养6周后,可以获得70%的再生率。将超低温保存后的再生植株移栽到温室条件下,进行营养生长和生殖生长的评价。结果发现,超低温保存后的再生植株与对照在生根和营养生长上具有一定的差异,但是植株的其他主要性状(包括叶形态,花形状,颜色,数量和大小)均没有显著性的差异。内部简单重复序列(ISSR)和扩增片段长度多态性(AFLP)对超低温保存后再生植株的遗传稳定性鉴定没有发现任何特异性条带。2.通过对感染CSVd的木茼篙两个品种‘Yellow Empire’和‘Border Dark Red’在温室生长的观测表明:感病植株矮小,植株形态不规则,花色不均匀或出现裂花现象,导致花朵品质明显降低。茎尖分生组织培养(0.2 mm,1-2个叶原基)、茎尖(2.5 mm,5-6个叶原基)超低温疗法及三种化学试剂(Rihavirin,Salicylic acid和Amantadine)不同浓度(25,50,100mg/l)处理均不能脱除CSVd。带毒组织培养植株经低温处理(5 oC,2-3个月)后,再进行茎尖分生组织培养(0.2 mm,1-2叶原基),能脱除CSVd,获得1株‘Yellow Empire’的脱毒苗、2株‘Border Dark Red’的脱毒苗。3.利用原位杂交(in situ hybridization)技术定位CSVd在茎尖的分布表明,CSVd能侵染茎尖顶端分生组织。组织解剖结果表明,茎尖超低温处理后,茎尖顶端分生组织和第一、二叶原基的细胞均能成活,因而不能脱除CSVd。随着低温处理时间的延长,茎尖的无毒区域增大,因而有助于通过茎尖培养获得无毒植株。4.CSVd在木茼篙不同组织、器官中的定位表明,CSVd在‘Yellow Empire’和‘Border Dark’的茎和花器中的分布没有差异,而在茎尖分生组织的侵染能力随基因型而异:在感染CSVd的‘Yellow Empire’和‘Butterfly’的茎尖中,CSVd可以侵染顶端分生组织,以及第一二片叶原基;在带毒的‘Border Dark Red’和‘Border Pink’的茎尖中,CSVd只能侵染茎尖基部的细胞,而不能侵染顶端分生组织和第一二片叶原基。组织学和透射电子显微镜观察表明,在‘Yellow Empire’和‘Border Dark Red’的茎尖分生组织中,维管束组织和胞间连丝的发育模式没有差异。免疫学定位研究发现,不同品种茎尖中胞间连丝上胼胝质的沉积数量具有显著的差异性:‘Yellow Empire’的胞间连丝上胼胝质的沉积远少于‘Border Dark Red’。因此,胼胝质沉积的差异性很可能是导致CSVd侵染不同木茼篙基因型茎尖能力差异的主要原因。上述研究为木茼篙属植物种质资源的超低温保存搭建了技术平台;阐明了茎尖培养与超低温疗法不能脱除CSVd的原因;解释了低温处理结合茎尖培养有利于脱除CSVd的原因,为建立有效脱除CSVd的方法提供了参考;揭示了CSVd侵染不同木茼篙基因型茎尖能力差异的机理。