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目的：棘阿米巴角膜炎(AK)是一种致盲率极高的慢性进行性角膜炎。由于发病早期常缺乏特异性临床表现、诊断方法欠敏感、特异性低，故常导致误诊、漏诊、误治。本研究采用分子生物技术双重PCR(multiplexPCR)，同时扩增棘阿米巴18srDNA和26srDNA基因片段，旨在探索一种快捷，方便，特异性、敏感性均高的早期诊断棘阿米巴角膜炎的方法。
方法：
1.棘阿米巴的培养和形态学研究：对延边医学院提供的三种己知基因序列的棘阿米巴(Acanthamoebasp.CJY/s基因型、CJY/s2基因型和Neff基因型)用PYG培养液培养、保种，并用革兰氏染色进行滋养体和包囊的形态学观察。
2.PCR及双重PCR扩增棘阿米巴18SrDNA和(或)26SrDNA基因方法学的建立。
3.棘阿米巴的动物(兔子)模型建立及双重PCR应用：用CYL/S2基因型棘阿米巴PYG悬浊液注射兔子左眼角膜基质层，使兔子感染棘阿米巴引起角膜炎；右眼做为对照，建立棘阿米巴角膜炎动物模型。观察兔子左、右眼变化。用双重PCR检测兔子两眼分泌物、眼冲洗液、眼角膜刮片及眼角膜活检组织。兔子两眼角膜病理切片并HE染色观察棘阿米巴滋养体及包囊的形态。
4.双重PCR法和无营养琼脂培养法检测：83例在校大学生无症状隐形眼镜配戴者保存盒内镜片放置过夜的液体、40例未曾使用过的隐形眼镜护理液、42例疑似棘阿米巴角膜炎患者眼分泌物及58例正常人眼分泌物。
结果：
1.三种不同基因型棘阿米巴肉眼观察，形态上没有多大差异。但据延边医学院提供的基因序列，可知Acanthamoeba，sp.CJY/s株和CJY/s2株同属T4基因型，A.castellaniiNeff属于Neff型。Acanthamoebasp.CJY/s和Neff株具有99％相同碱基。Gram染色后，镜下清晰可见包囊双层囊壁结构，亮圈状。滋养体形态较难形容，但可以清楚看见其内含的食物泡和细胞核。
2.PCR反映体系共30μl。其中含模板DNA5μl，引物(5μmol/L)2μl，Taq酶(1.5U/μl)0.3μl。反应参数如下：94℃5min，94℃40s，复性温度40s，72℃45s。共35个循环，最后72℃5min。由于引物不同，复性温度值也不同。引物Q-1、JDP和FT对应的复性温度值分别为50℃、55℃和61℃，双重PCR的复性温度值为60℃。单一PCR扩增三种棘阿米巴虫株18SrDNA，JDP和Q-1引物均扩增出分子量大小为463bp和188bp的特定扩增带。单一PCR扩增三种棘阿米巴虫株26SrDNA，Acanthamoebasp.CJY/s2株和A.castellaniiNeff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126bp的特定扩增带，而Acanthamoebasp.CJY/s株未得到预期的扩增带。双重PCR同时扩增三种不同基因型棘阿米巴、大肠杆菌、流感病毒的18SrDNA和26SrDNA基因。Acanthamoebasp.CJY/s2株和A.castellaniiNeff株中分别扩增出分子量大小为463bp和126bp的特定扩增带。而Acanthamoebasp.CJY/s株仅扩增出分子量大小为463bp的特定扩增带。大肠杆菌和流感病毒未有扩增出任何条带，说明该检测方法具有高特异性。PCR检测棘阿米巴灵敏度为8个病原。
3.双重PCR检测兔子左眼分泌物、眼冲洗液、眼角膜刮片和眼活检角膜组织提取的核酸中均扩增出分子量大小为463bp和126bp的特定扩增带；右眼四种物质均未扩增出任何条带。兔子角膜病理切片HE染色后镜下可见：兔子右眼(对照组)角膜组织结构清楚，兔子左眼(实验组)上皮细胞层、前弹力层溃破，大量炎性细胞浸润。上皮细胞层中看见棘阿米巴包囊，基质层内看见棘阿米巴滋养体。
4.双重PCR检测结果：83例隐形眼镜保存盒内液体，阳性1例，经核实该病人曾经患有棘阿米巴角膜炎，药物治疗后好转；40例未曾使用过的隐形眼镜护理液均为阴性；42例疑似病人眼分泌物，阳性2例，其中1人为隐形眼镜配戴者，1人曾有角膜外伤史；58例正常人眼分泌物均为阴性。琼脂培养结果：123例隐形眼镜保存盒内液体均阴性；42例疑似病人眼分泌物，阳性2例，即为双重PCR检测阳性患者；58例正常人眼分泌物均为阴性。检测是否感染棘阿米巴的“金标准”到目前为止是培养病原阳性。但结合病史，双重PCR的阳性检测率优于金标准。
结论：
1.双重PCR具有高特异性，敏感性，能够有效的防止误诊。与单一的PCR扩增相比，双重PCR技术更好地防止了由于棘阿米巴属的基因分型过多造成的漏诊。
2.双重PCR技术应用于检测早期棘阿米巴角膜炎病，在感染8个棘阿米巴病原即可做出诊断。虽然该技术实验结果容易受外界条件影响，但取材的无创伤性、样本需要量、检测所需时间及阳性检测率均优于普通培养。通过临床实验，验证双重PCR有临床实用价值，建议推广临床检测。
3.在我国，应用双重PCR技术检测早期棘阿米巴角膜炎，在棘阿米巴角膜炎的早期诊断上是一项突破。早诊断、早治疗可防治因感染棘阿米巴而出现眼失明。