研究背景软骨是分布在长骨的两端,其生理作用是承重、耐磨、低摩擦界面,使关节在运动时不会产生疼痛。但是软骨没有血管、神经、淋巴组织和低细胞分布密度,这导致软骨在受到损伤时很难修复或者修复成僵硬的纤维软骨,容易导致骨性关节炎,造成患者的疼痛或者关节的残疾,给患者造成严重的精神和身体不适。关节软骨在临床上十分常见,许多创伤造成直接的软骨损伤如关节内骨折、或者间接的造成软骨损伤如关节周围的韧带损伤后造成软骨损伤;许多病理条件能造成软骨损伤如骨性关节炎、肢端肥大、血友病、内风湿关节炎等。软骨组织工程是将种子细胞(干细胞或者软骨细胞)和细胞因子接种在各种不同的生物支架上用来修复软骨缺损,利用细胞分泌的胞外基质逐渐替代支架,与周围正常软骨整合,达到修复软骨的目的。组织工程技术为基础的软骨细胞移植方法经历了三个发展阶段:第一代ACI技术:1984年Peterson报道在兔关节软骨缺损模型中,用可吸收缝线将自体骨膜作为覆盖膜缝于软骨缺损周缘,将体外扩增的自体软骨细胞悬液注入缺损,术后16周修复组织为透明样软骨;第二代ACI技术:2006年Gooding等报道用Ⅰ/Ⅲ型胶原薄膜代替骨膜进行对照研究,术后2年随访证实修复效果与骨膜组比无差异,其优点避免了因获取骨膜而增加额外创伤,但可能存在细胞外漏、覆盖膜脱落等问题。为了克服ACI技术缺点,研究者将扩增的软骨细胞种植在Ⅰ/Ⅲ胶原支架上,共培养后用生物胶固定于缺损,此技术为第三代ACI技术,即基质诱导的自体软骨细胞移植(MACI)。然而这些方法在修复软骨缺损上的疗效并不是十分理想,原因在于:(一)体外扩增的软骨细胞增殖能力有限,且易发生细胞表型改变。ACI技术和MACI技术均需对软骨细胞进行体外扩增,由于体外难以模拟在体微环境,尤其是缺乏机体免疫系统的监控,扩增的软骨细胞容易发生去分化。表现为软骨细胞向成纤维细胞转变,透明软骨基质的主要成分Ⅱ型胶原蛋白基因表达减少,而纤维软骨的主要成分Ⅰ型胶原纤维基因表达增加。软骨细胞表型的改变必将影响其体内分泌基质的功能,从而导致再生软骨质量缺陷。(二)植入的支架材料与天然软骨基质存在较大的差异。ACI技术单纯使用软骨细胞悬液,由于缺少细胞外基质的固定与支撑,最终再生的修复组织生物力学性能较差、耐磨持久性不佳。MACI技术使用Ⅰ/Ⅲ胶原为细胞支架材料,与天然软骨基质存在较大的差异,使用的支架成分为Ⅰ、Ⅲ胶原而不是透明软骨中的Ⅱ型胶原,支架成分类似于皮肤而不是透明软骨,因此形成的组织无论在结构上还是成分上都与天然软骨存在本质差异。我们课题组旨在研究出Ⅱ型胶原蛋白(COLII)—硫酸软骨素(CS)—透明质酸(HA)三者的仿生水凝胶,再确保生物安全的基础上,与种子细胞(软骨微粒)结合构建仿生软骨,用来修复小香猪的膝关节软骨全层缺损,证实仿生凝胶复合软骨微粒修复软骨缺损的可行性。研究方法1、用高碘酸钠氧化CS,对氧化的CS进行红外光谱检测;采用不同的比例制备COLII-HA-CS仿生凝胶,得出最佳成胶比例。2、取新西兰大白兔,用软骨微粒获取装置在兔子膝关节的股骨滑车处磨取软骨微粒,将软骨微粒混合于COLII-HA-CS仿生凝胶中,在体外培养,在3d,7d,14d,21d,25d,30d取标本,做组织切片HE染色,观察到微粒中的软骨细胞均存活情况。3、取15头贵州小猪,共30膝,随机分为两组,每组15膝,麻醉,铺无菌单,逐步切开皮肤、关节囊,暴露关节滑车,用直径8mm的套筒确定软骨缺损范围,用软骨微粒获取装置获取粒径为100-200um的微粒并制作好直径为8mm的软骨全层缺损,以软骨微粒:仿生凝胶为3:1的比例混合均匀,植入缺损区域,对照组为单纯软骨缺损。术后1、3、6月取标本,分别进行大体、体式显微镜及组织学观察,同时用ICRS对大体组织和O’Driscoll组织学评分对软骨缺损处的修复效果进行评价。研究结果:1、氧化的硫酸软骨素从红外光谱上看,氧化的硫酸软骨素红外光谱显示:波长在1750cm处出现新的吸收峰,其是醛基中的C=0吸收峰;以COLII-HA:CS按2:1、3:1、4:1、5:1的比例成胶,最终以3:1成胶的效果最好。2、软骨微粒与仿生凝胶混合培养在3d,7d,14d,21d,25d,30d,取标本做组织切片HE染色,观察到微粒中的软骨细胞均存活。3、成功的将软骨微粒复合仿生凝胶植入软骨缺损,术后1月,对照组见少许修复组织形成,软骨下钙化层不连续,部分可见软骨下骨破坏、塌陷,缺损处颜色为淡黄色。实验组见大部分修复组织覆盖缺损,新生组织颜色接近正常软骨颜色,术后3月及6月,对照组大体组软骨表面粗糙,有裂隙存在,软骨下骨塌陷,钙化层不连续。实验组大体及组织切片观察发现修复组织完全覆盖缺损,与周围正常软骨整合良好,表面光滑,细胞分布均。实验组术后1月ICRS评分:14±1.2,3月ICRS评分:17.8±1.31,术后6月ICRS评分:19.4±0.89;对照组术后1月ICRS评分:0.6±0.89,3月ICRS评分:12.4±2.4,术后6月ICRS评分:18.2±0.44;实验组术后1月O’Driscoll评分:13±1.22,3月O’Driscoll评分:15.8±1.30,术后6月O’Driscoll评分:17.2±0.84;对照组术后1月O’Driscoll评分:2.2±0.45,3月O’Driscoll评分:5.2±0.84,术后6月O’Driscoll评分:7.2±0.44(各时间点n=5,p<0.05)。研究结论:1、高碘酸钠能够氧化硫酸软骨素,使硫酸软骨素产生醛基基团,氧化后的硫酸软骨素能够和胶原蛋白发生schiff-base交联反应,生成一种新型水凝胶。2、氧化的硫酸软骨素能与COLII-HA复合溶胶发生交联反应,形成在满意的仿生凝胶,仿生凝胶混合软骨微粒在体外培养一个月软骨微粒中的软骨细胞存活,为体内动物实验提供理论依据。3、软骨微粒复合仿生凝胶植入软股缺损处,能够修复膝关节局灶性软骨缺损,修复组织表面平整,与周围正常软骨整合良好,修复组织基质多以Ⅱ型胶原蛋白为主,各时间点实验组修复效果均好于对照组(p<0.05)。