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实验目的 采用高菌量牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)感染小鼠口腔的方法建立牙周炎动物模型，明确牙周炎发病过程中辅助性T(Thelper，Th)17细胞和调节性T(regulatoryT，Treg)细胞的免疫状态;通过体内对P.gingivalis诱导的牙周炎小鼠进行全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)干预和体外采用维甲酸受体(retinoidacidreceptor，RAR)α拮抗剂LE135阻断的实验体系，明确ATRA对牙周炎的作用，分析ATRA对牙周炎中Th17细胞和Treg细胞免疫状态的影响并进一步探讨相关的作用机制。 实验方法 1、Th17细胞和Treg细胞在牙周炎小鼠中的免疫状态分析 选用7周龄C57BL/6雌性小鼠，以1×109P.gingivalisW83连续7天感染小鼠口腔，建立牙周炎动物模型。于感染后的第4周取材，通过测量从釉牙骨质界(cemento-enameljunction，CEJ)到牙槽嵴顶的距离(alveolarbonecrest，ABC)评价牙槽骨吸收情况;采用苏木素-伊红(Hematoxylinandeosin，HE)染色的方法观察牙周组织中炎细胞浸润、结缔组织附着丧失和牙槽骨吸收情况;应用流式细胞仪分析技术检测颈部淋巴结、外周血和脾脏中CD4+T细胞在淋巴细胞中的细胞比例、CD4+维甲酸相关核孤儿受体(retinoid-relatedorphanreceptor，ROR)γτ+(RORγτ为Th17细胞特征性转录因子）、CD4+叉头翼螺旋转录分子(forkheadboxP3，Foxp3)+(Foxp3为Treg细胞特征性转录因子)和核因子-κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand，RANKL)+CD4+细胞在总的CD4+T细胞中的细胞比例和细胞数量;应用实时定量反转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)方法检测牙龈组织和颈部淋巴结中Th17细胞相关因子白细胞介素(interleukin，IL)-17A和Treg细胞相关细胞因子IL-10和转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β1mRNA的表达;酶联免疫吸附技术(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)检测牙龈组织、颈部淋巴结、血清和脾脏中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表达情况。 2、ATRA对牙周炎小鼠Th17细胞和Treg细胞免疫状态的影响及相关机制研究 选用7周龄C57BL/6雌性小鼠，以P.gingivalis诱导建立的牙周炎小鼠为研究对象，体内隔日灌胃ATRA(25μg/g体重)和体外给予不同实验组ATRA(2×10-5mol/L)及ATRA(2×10-5mol/L)+维甲酸受体(retinoidacidreceptor，RAR)α阻断剂LE135(2×10-5mol/L)，进行实验研究。动态监测小鼠的体重，观察P.gingivalis感染后小鼠的体重变化;测量从CEJ到ABC的距离评价牙槽骨的吸收情况;HE染色法观察牙周组织中炎细胞浸润、结缔组织附着丧失和牙槽骨吸收情况;应用流式细胞仪分析技术检测颈部淋巴结、外周血、脾脏以及体外培养细胞中CD4+T细胞在淋巴细胞中的细胞比例、CD4+RORγτ+(Th17)、CD4+Foxp3+(Treg)和RANKL+CD4+细胞在总的CD4+T细胞中的细胞比例和细胞数量;应用实时定量RT-PCR方法检测牙龈组织和颈部淋巴结中Th17细胞相关细胞因子IL-17A和Treg细胞相关细胞因子IL-10和TGF-β1mRNA的表达;ELISA方法检测牙龈组织、颈部淋巴结、血清、脾脏和体外培养细胞上清中IL-17A、IL-10和TGF-β1的蛋白表达水平;应用四甲基偶氮唑蓝(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphen-yltetrazoliumbromide，MTT)法检测颈部淋巴结和脾脏淋巴细胞的增殖情况。此外，为了排除ATRA对P.gingivalisW83的直接作用，以不同浓度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA处理P.gingivalisW83，通过比色法分析P.gingivalisW83生长率;以不同浓度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)ATRA处理的P.gingivalisW83与1％羊红细胞共培养，观察红细胞的凝集情况;以不同菌量(3×109、2×109、1×109)ATRA(2×10-5mol/L)处理的P.gingivalisW83皮下注射，观察小鼠的生存情况和测量注射区皮损大小。 实验结果 1、在牙周炎中存在Th17/Treg免疫失衡 (1)与P.gingivalis感染对照组小鼠相比，牙周炎小鼠的Th17细胞在CD4+T细胞中的细胞比例和细胞数量显著增加，而Treg细胞的细胞比例明显降低，Treg细胞的细胞数量变化不显著; (2)与P.gingivalis感染对照组小鼠相比，虽然牙周炎小鼠Th17细胞相关促炎性细胞因子IL-17A以及Treg细胞相关抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1表达增高，但IL-10和TGF-β1不能有效对抗增高的IL-17A，不能抑制牙周炎。 此外，与P.gingivalis感染对照组小鼠相比，牙周炎小鼠的牙龈组织、颈部淋巴结和外周血中Th17细胞和Treg细胞及相关细胞因子的变化较脾脏明显。 2、ATRA通过调控Th17/Treg免疫失衡抑制牙周炎 (1)ATRA抑制P.gingivalis诱导的小鼠牙周炎:ATRA有效抑制P.gingivalis诱导的牙槽骨吸收，减轻牙周组织的炎症程度和结缔组织附着丧失。 (2)ATRA显著下调Th17细胞介导的免疫应答，上调Treg细胞介导的免疫应答:体内外实验中，ATRA有效降低CD4+RORγτ+(Th17)细胞的细胞比例和细胞数量并下调其相关的促炎性细胞因子IL-17A的表达，降低RANKL+CD4+细胞的细胞比例和细胞数量，同时增加CD4+Foxp3+(Treg)细胞的细胞比例并上调其相关的抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1的表达。体外研究发现，ATRA对Th17/Treg免疫失调的调控作用以及对RANKL+CD4+细胞的抑制作用可被RARα拮抗剂LE135阻断。而且，我们从P.gingivalisW83的生长率、凝集能力和毒力三个方面分析了ATRA对P.gingivalisW83的直接影响。研究发现，虽然ATRA能降低P.gingivalisW83的生长率，但差异无统计学意义;在凝集功能方面，不同浓度(2×10-5mol/L、2×10-6mol/L、2×10-7mol/L)的ATRA对P.gingivalisW83凝集羊红细胞的功能无明显影响;在相同菌量注射后，ATRA对小鼠的生存率无明显影响，并且虽然在注射后的第2天和第6天ATRA组小鼠的皮损小于DMSO对照组，但差异无统计学意义。 此外，ATRA组小鼠牙龈组织、颈部淋巴结和外周血中Th17细胞和Treg细胞及相关的细胞因子受ATRA的影响较脾脏更为显著。 结论 1、在牙周炎小鼠中存在Th17/Treg免疫失衡状态，表现为Th17细胞介导的免疫应答增强，而Treg细胞介导的免疫应答减弱。 2、牙龈组织、颈部淋巴结和外周血可能是宿主对抗牙周致病菌产生免疫应答的主要细胞来源。 3、ATRA通过调控Th17/Treg免疫失衡—抑制Th17细胞介导的免疫应答同时增强Treg细胞介导的免疫应答，进而抑制P.gingivalis诱导的牙周炎。 4、ATRA通过作用于牙龈组织、颈部淋巴结和外周血，活化RAα，调控牙周炎中Th17/Treg免疫失衡状态。