肺癌是世界范围内最常见并导致肿瘤相关性死亡的癌症之一。它主要包括非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞型肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两种类型,分别约占发病率的85%和15%。虽然临床监测和治疗方案已取得了很大的进步,但NSCLC的发展转移仍是其高致死率最常见的原因。肿瘤发展是一个复杂的过程。首先,癌细胞无限制性生长;然后癌细胞自原发肿瘤脱落并侵入周围组织或渗入血液和淋巴系统;最终,癌细胞停留并定居在靶器官。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一种分泌的锌离子依赖型内肽酶,它在肿瘤的转移过程中起重要作用。在生理和病理过程中,它可以降解多种细胞外基质成分,例如:胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白和弹力蛋白。有报道指出,MMPs的表达受丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPKs)通路的调节。同时,细胞增殖、迁移与侵袭的调节涉及MAPKs。尽管科研人员对细胞迁移和侵袭的机制有了逐渐的了解,但目前通过调节这些机制来阻止肿瘤发展的药物疗效很有限。天然的化学预防或治疗性药物已被广泛关注。黑种草,属毛莨科,是年生草本植物,它被作为很多种疾病的传统天然治疗的中药材已有两千多年的历史了。百里香醌(thymoquinone,TQ)是黑种草籽油的主要生物活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用。在过去的十年中,大量的文献报道指出:TQ可以抑制多种癌症,包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌等。先前的研究也显示TQ对癌症发展的多个过程起抑制性作用,包括细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管发生。另外,TQ可以协同增强传统药物对癌细胞的抑制作用,例如:NCI-H460非小细胞型肺癌细胞和U266多发性骨髓瘤细胞。然而,TQ抗肿瘤作用的分子机制仍未被阐明,并且其对肺癌的潜在治疗作用仍不十分清楚。基于上述研究结果,为了了解TQ对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用的分子机制,进而探索TQ对肺癌的潜在治疗作用,我们研究了:(1)TQ对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。(2)TQ对A549细胞MMPs活性与表达的影响。(3)TQ对A549细胞MAPKs信号通路的影响。(4)TQ通过ERK1/2信号通路抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭。第一部分TQ对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的:研究TQ对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响,进而探讨TQ对肺癌肿瘤发展和转移的抑制作用。方法:A549细胞为人肺腺癌细胞,购买于上海生命科学细胞资源中心,并将细胞在RPMI 1640培养基中进行培养。培养基中含有:10%胎牛血清、100 units/m L青霉素、100 mg/m L链霉素。培养箱的CO2浓度维持在5%,温度维持在37℃。浓度为0.25%的胰酶(含有0.02%EDTA)用于细胞传代,每周3次。本研究用四甲基噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和细胞计数法研究不同浓度(0,5,10,20,40,80,160μmol/L)TQ和不同处理时间(0,24,48,72 h)对A549细胞增殖活性的影响。另外,我们用Western-blot和实时定量RT-PCR方法检测了TQ对A549细胞增殖标志性基因PCNA蛋白表达和PCNAm RNA的影响。细胞划痕实验用于检测TQ对A549细胞迁移的影响。A549细胞在12孔培养板内生长至80~90%融合后用于实验。将单层细胞划痕,然后用浓度为0、10、20、40μmol/L的TQ分别将细胞处理24、48、72 h;另外,用浓度为40μmol/L的TQ分别将细胞处理24、48、72 h。细胞迁移活性用迁移至划痕处的细胞数量来表示。Transwell小室法用于检测TQ对A549细胞侵袭活性的影响。将A549细胞用浓度为0、10、20、40μmol/L的TQ分别处理24、48、72 h;另外,用浓度为20μmol/L的TQ分别将细胞处理24、48、72 h,然后用于实验。结果1 TQ对A549细胞增殖起剂量依赖性和时间依赖性抑制作用。但是,浓度为5μmol/L TQ没有明显的改变细胞的增值活性。并且,在40μmol/L时,TQ对A549细胞增殖活性起明显的抑制作用(P<0.01)。另外,TQ对A549细胞增殖标志性基因PCNAm RNA和蛋白的表达具有剂量依赖性和时间依赖性抑制作用,浓度为10、20、40μmol/L时尤其明显(P<0.01)。这些结果说明TQ对肺癌细胞增殖起抑制性调节作用。2 TQ对A549细胞迁移起剂量依赖性和时间依赖性抑制作用(P<0.01)。结果表明TQ对肺癌细胞迁移起抑制性调节作用。3 TQ对A549细胞侵袭起剂量依赖性和时间依赖性抑制作用(P<0.01)。结果表明TQ对肺癌细胞侵袭起抑制性调节作用。结论:TQ可以抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭活性。这些结果表明TQ可能对肺癌的肿瘤发展和转移具有抑制性调节作用。第二部分TQ对A549细胞MMPs活性与表达的影响目的:研究TQ对A549细胞MMPs活性与表达的影响,进而探讨TQ对细胞外基质降解的作用。方法:细胞培养方法同第一部分。A549细胞接受不同剂量和时间的TQ处理后,利用Western-blot和RT-PCR的方法检测细胞MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2的表达变化。并用明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的明胶酶活性。结果1 TQ对A549细胞MMP2和MMP9蛋白表达具有剂量依赖性抑制作用(P<0.01)。2 TQ对A549细胞MMP2和MMP9的m RNA表达具有剂量依赖性抑制作用(P<0.01)。3 TQ对A549细胞TIMP1和TIMP2的表达没有明显的影响。4 TQ对A549细胞MMP2和MMP9的活性具有浓度依赖性抑制作用(P<0.01)。结论:TQ可以抑制A549细胞MMP2和MMP9的表达和活性。这些结果表明TQ在细胞外基质降解过程中起重要作用,进而影响细胞的迁移和侵袭。第三部分TQ对A549细胞MAPKs信号通路的影响目的:研究TQ对MAPKs信号传导通路的影响,进而探讨TQ抑制作用的信号机制。方法:细胞培养方法同第一部分。首先,用浓度为40μmol/L的TQ处理A549细胞,时间分别为0、4、8、12、24和48 h;然后收集各个样本的总蛋白溶解物并进行Western-blot检测。检测指标为:phospho-ERK1/2、ERK1/2、phospho-JNK、JNK、phospho-p38和p38。结果:TQ以时间依赖性方式抑制ERK1/2的磷酸化,但是其对p38和JNK的表达和磷酸化水平没有明显的影响。结论:TQ可以抑制A549细胞ERK1/2的磷酸化。结果表明TQ可能通过抑制ERK1/2的磷酸化影响ERK1/2信号通路,进而影响细胞增殖、迁移和侵袭。第四部分TQ通过ERK1/2信号通路抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭。目的:研究ERK1/2抑制剂(PD98059)与TQ协同作用对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以便证实TQ对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用是否依赖ERK1/2信号通路的抑制。方法:细胞培养方法同第一部分。将细胞分为四组:1组,不做任何试剂处理;2组,用浓度为40μmol/L的TQ处理A549细胞48h;3组,浓度为20μmol/L的PD98059处理A549细胞2h;4组,首先用浓度为20μmol/L的PD98059处理A549细胞2h,然后用浓度为40μmol/L的TQ处理A549细胞48h。最后收集细胞进行Western-blot检测,检测指标为:MMP2,MMP9,ERK1/2和p-ERK1/2。并将培养基收集,并用明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的活性。MTT和细胞计数用于检测细胞的增殖活性。划痕实验和transwell小室检测法分别用于检测细胞的迁移和侵袭活性。结果1 TQ和PD98059对A549细胞MMP2和MMP9表达和活性的影响为了证实TQ通过ERK1/2信号途径发挥其抑制作用,我们检测了TQ与ERK1/2抑制剂PD98059联合作用于A549细胞后,各项指标的变化情况。研究结果显示:TQ降低了MMP2和MMP9的表达和活性,而这种抑制作用可以被ERK1/2抑制剂PD98059阻断(P<0.01)。2 TQ和PD98059对A549细胞ERK1/2蛋白表达和磷酸化的影响结果显示:TQ使A549细胞ERK1/2蛋白的磷酸化减弱(P<0.01)。另外,TQ和PD98059对A549细胞ERK1/2蛋白的表达没有明显的影响。3 TQ和PD98059对A549细胞增殖的影响MTT和细胞计数的研究结果显示:TQ降低了A549细胞的增殖活性,而这种作用可以被PD98059阻断(P<0.01)。4 TQ和PD98059对A549细胞迁移的影响细胞划痕实验结果显示:TQ降低了A549细胞的迁移活性,而这种作用可以被PD98059阻断(P<0.01)。5 TQ和PD98059对A549细胞侵袭的影响Transwell小室实验结果显示:TQ降低了A549细胞的侵袭活性,而这种作用可以被PD98059阻断(P<0.01)。结论:TQ可以抑制A549细胞ERK1/2的磷酸化,抑制MMP2和MMP9的表达和活性,抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭活性。上述这些作用可以被ERK1/2抑制剂PD98059阻断。结果表明TQ可能通过ERK1/2信号途径对肿瘤的发展和转移起抑制性调节作用。