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研究背景高血糖或高血脂是糖尿病的标志，会导致心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌易损性的增加。糖尿病患者发生心肌缺血时，心肌细胞死亡数量、心功能损伤程度及再灌注后无复流现象较非糖尿病患者显著增加。但是，糖尿病心肌缺血损伤加重，进而导致死亡率增高的机制尚未完全阐明。所以，阐明糖尿病MI/R损伤的分子机制至关重要，有望为防治糖尿病MI/R损伤提供新思路和新靶点。脂联素是主要由脂肪细胞分泌的一个细胞因子，主要发挥增强胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化及心脏保护作用。脂联素水平在肥胖相关疾病如冠状动脉疾病和2型糖尿病时均显著下降。而给予外源脂联素或增加脂联素的分泌均可通过增强胰岛素敏感性降低血糖。近年来发表的一些文献表明心肌细胞同样可以合成和分泌脂联素，认为心肌细胞分泌的脂联素在保护缺血/再灌注(I/R)后心肌损伤方面发挥重要作用。FoxO家族是近年来的一个研究热点，参与多种生物反应过程，包括细胞周期，细胞死亡，分化，代谢，并且在胰岛素信号通路中发挥重要作用。FoxO1是FoxO家族中研究最多、作用最强的一种亚型。很多研究均表明糖尿病高甘油三脂血症与FoxO1引起的葡萄糖和脂肪代谢失调密切相关。尽管有研究表明FoxO1可以促进脂肪组织脂联素表达的增加，但其它研究结果证实在糖尿病时FoxO1会抑制促进脂联素表达的PPARγ基因的表达，所以FoxO1对脂联素表达的调节可能与病生理状态、细胞类型和上游信号有关。因此我们设想：糖尿病时FoxO1的过度生成引起的脂联素水平下降可能是I/R后心肌损伤加重的重要原因。本研究拟对该假设进行验证，进而阐明分子机制，为进一步阐明糖尿病I/R后心肌损伤加重的机制提供新的实验依据。研究目的1．建立糖尿病小鼠心脏I/R模型，观察糖尿病小鼠心脏组织是否存在FoxO1激活，FoxO1激活与糖尿病小鼠MI/R损伤加重是否有关；2．在体心肌点注射FoxO1siRNA抑制其表达，观察脂联素及其受体的变化以及MI/R损伤的变化，明确FoxO1过度生成在2型糖尿病MI/R后心肌易损性增强中的作用以及；3．在高糖培养心肌细胞实验中，观察高糖作用下FoxO1是否被激活；转染FoxO1siRNA后观察脂联素表达变化，以及SI/R后AdipoR1表达和细胞凋亡的变化。在细胞水平验证MI/R时FoxO1对脂联素及AdipoR1信号的调节作用及具体分子机制；4．APN-/-小鼠心肌点注射FoxO1siRNA，观察MI/R损伤的变化，进一步验证在糖尿病动物MI/R损伤时，下调FoxO1是否会通过逆转脂联素及其受体的下调，进而起到心脏保护的作用。研究方法1．选取体重20-25g雄性C57B16/J小鼠，高脂饲料喂2w，腹腔注射50mg/kgSTZ，继续高脂喂养6w，血糖≥10mmol/L认为糖尿病模型成功。2.体内导入siRNA：2%异氟烷麻醉小鼠，消毒皮肤，挤出心脏，在预计动脉结扎部位下方用30G针头心肌点注射FoxO1siRNA/RNAi-Mate复合物20μg/20μL，大约注射2-3个点。48小时后行MI/R。3.小鼠MI/R模型：用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支中点处结扎，30min后再灌注。再灌注3h后检测心肌细胞凋亡及相关蛋白表达，再灌注24h后检测心功能及心梗面积。假手术组采用同样的方法处理，区别在于不结扎LAD。4.乳鼠心肌细胞高糖培养（25mmol/L）24h后转染FoxO1siRNA/RNAi-Mate复合物，24h后行SI/R。5.心肌梗死面积测定：伊文氏蓝/三苯四唑氯盐（TTC）双染色法。6.心肌细胞凋亡检测：①末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法；②Caspase-3活性测定（ELISA）。7. Western-blot检测FoxO1、脂联素及AdipoR1蛋白水平。8.实时定量PCR检测FoxO1mRNA水平。实验结果1.相较于正常小鼠，2型糖尿病小鼠心肌FoxO1蛋白表达增加（P<0.05），而心肌来源的脂联素（P<0.05）与AdipoR1表达减少（P<0.05）。同时，I/R后2型糖尿病小鼠心肌梗死面积增加（P<0.05）、心肌细胞凋亡增多及caspase-3活性进一步增加（P<0.05）。2.给予心肌点注射FoxO1siRNA可以有效减少糖尿病小鼠过度生成的FoxO1mRNA及蛋白（P<0.05）。而心肌FoxO1表达的下降促进心肌来源的脂联素与AdipoR1表达的恢复（P<0.05）。3.抑制糖尿病小鼠心肌FoxO1表达可明显减少MI/R后的心梗面积（P<0.05）、改善心功能（P<0.05），同时抑制心肌细胞凋亡（P<0.05）及caspase-3活性（P<0.05）。另外，与脂联素变化一致，其下游AMPK活性恢复。4.相较于正常条件培养，高糖培养的小鼠心肌细胞FoxO1mRNA及蛋白表达增加（P<0.05），转染FoxO1siRNA可有效抑制FoxO1mRNA及其蛋白表达（P<0.05）。抑制FoxO1表达可促进高糖条件下脂联素水平的恢复（P<0.05），可促进高糖培养条件下SI/R后AdipoR1表达的恢复（P<0.05）以及心肌细胞凋亡的减轻（P<0.05）。5. APN-/-小鼠心肌点注射FoxO1siRNA后可减少FoxO1mRNA表达（P<0.05），但抑制FoxO1表达对APN-/-小鼠MI/R损伤没有显著的保护作用。结论1.糖尿病小鼠较正常小鼠心肌FoxO1表达增高，而对MI/R损伤有保护作用的脂联素与AdipoR1表达减少，提示FoxO1可能通过下调糖尿病心肌脂联素信号加重MI/R损伤。2.给予心肌点注射FoxO1siRNA抑制FoxO1表达可减轻糖尿病MI/R损伤，同时心肌来源的脂联素和AdipoR1表达恢复。进一步提示糖尿病状态下FoxO1过度生成引起的脂联素减少是引起糖尿病小鼠MI/R损伤加重的原因。3.高糖培养的心肌细胞实验进一步阐明了高糖引起FoxO1过度生成与脂联素减少、心肌细胞凋亡增加的关系。4.给予APN-/-小鼠心肌点注射FoxO1siRNA可以有效抑制心肌FoxO1mRNA水平，但对APN-/-小鼠MI/R损伤无明显影响。再次证实FoxO1对脂联素信号的调节作用。研究提示控制糖尿病小鼠FoxO1过度生成对减轻糖尿病小鼠MI/R损伤有非常重要的意义。