紫草ERF基因的克隆、表达及乙烯调控紫草宁合成的机制研究

来源 :南京大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:WSZHOUSHUWU
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
紫草是一种重要的药用植物,其根部合成的红色萘醌类次生代谢产物-紫草宁及其衍生物具有抗菌、消炎、活血、抗肿瘤等多种功效,同时也是一种天然的染料。采用两阶段培养技术,已经建立了大量生产紫草宁及其衍生物的紫草细胞培养体系。目前虽然已基本清楚了紫草宁生物合成的基本途径,并分离、克隆和鉴定了许多与紫草宁合成相关的代谢酶及其基因,但其合成调控机制还很不清楚。在运用cDNA芯片技术研究不同光信号(黑暗,白光,红光,蓝光)处理下大规模的基因表达谱的研究中,本课题组在前期研究工作中克隆到了一个在黑暗下上调表达的乙烯响应因子基因-ERF,这个基因的表达模式与紫草宁合成受光信号调控的模式不谋而合。这些结果暗示了这个ERF类的转录因子和乙烯信号可能与紫草宁的合成调控有密切的联系,为我们后续的基因克隆、表达分析和乙烯调控紫草宁合成的分子机制的研究提供了依据。   我们克隆得到的紫草乙烯响应因子ERF基因的cDNA全长共652 bp,包含了完整的ORF和poly(A)尾,该基因编码了一个含127 aa的蛋白,BLASTX和进化树分析显示,该基因与茄属的一个ERF类的转录因子基因PTI5,拟南芥中的ERF1等最为接近,因此该基因是一个在紫草中发现的编码ERF类转录因子的基因。在随后的ERF基因的表达分析中,我们发现,在8 d的培养周期内,相对于白光培养,黑暗显著上调了ERF基因的表达;另外,紫草在白光预培养2 d或是5 d后转入黑暗,ERF基因的表达也显著上调,这些结果表明光信号参与调控了紫草ERF基因的表达。我们还检测了ERF基因在黑暗M9培养条件的早期(1 d内)表达模式,结果表明,在培养的前2 h内,ERF基因被快速诱导,随后又逐渐下降到一个稳定的高于在B5培养基中的水平,这种表达模式与紫草宁合成相关基因中的PAL,4CL,HMGR的早期应答模式类似(数据未显示),这些结果暗示了此ERF基因的快速应激可能与紫草宁的合成调控有密切的联系。   在紫草ERF基因全长cDNA的基础上,我们应用改造的pBI121-EGFP载体成功构建了紫草ERF基因的过表达植物表达载体,并将其成功地导入到根癌农杆菌EHA105中,为通过遗传转化的方法来深入研究紫草ERF基因的功能奠定了基础。   在拟南芥中,ERF1在乙烯信号的下游起作用,作为核内转录因子级联的最后一个步骤介导了一系列乙烯响应基因的表达。因此,我们在紫草细胞培养体系中运用药理学方法研究了乙烯合成前体ACC,乙烯抑制剂AVG,Ag+等对紫草宁合成的影响。结果显示,低浓度的ACC对紫草宁的产量影响不显著,而高浓度的ACC(100μM)则显著抑制了紫草宁的合成,同时还促进紫草细胞的增殖;乙烯合成抑制剂AVG在5μM处理时显著促进了紫草宁的合成,5μM Ag+(信号转导抑制剂)处理同样显著促进紫草宁的合成;而ACC可以“挽救”AVG的效应,不能“挽救”Ag+的效应。随后,我们运用半定量RT-PCR方法初步检测了ACC和Ag+处理对紫草宁合成相关基因(PAL,C4H,4CL,HMGR,PGT,CYP98A6和LeDI-2)的影响。结果表明,Ag+略微上调PAL,4CL,CYP98A6的表达,强烈上调LeDI-2的表达,略微下调HMGR的表达,而ACC对紫草宁合成相关酶基因的表达无明显影响,但明显下调LeDI-2基因的表达,这些结果说明,乙烯信号可能参与了通过影响紫草宁合成相关酶基因和LeDI-2基因的表达来调控紫草宁的合成。   而有文献报道乙烯却促进了无激素MS培养基中紫草茎段培养体系中紫草宁的合成,由此可见,乙烯的效应可能还极为复杂。我们提出了一个“剂量依赖性”模型来试图解释乙烯为何在同种植物材料不同培养体系中的效应却不同。该模型认为,乙烯可能只是在一定浓度范围内才对紫草宁的合成起到正调控作用,而过高浓度的乙烯则会对紫草宁的合成产生抑制作用。我们推测,在无任何激素的MS培养基中的紫草茎段培养体系产生的本底的乙烯浓度可能极低,因此添加外源的少量ACC(1μM)则可使乙烯的含量处于适合的浓度范围内从而促进了紫草宁的产生,而在含大量激素的M9培养基中的紫草细胞培养体系产生的本底的乙烯可能已经很高,以致超过了适合的乙烯浓度,此时再添加更多的外源ACC就将抑制紫草宁的合成,而用适当剂量的抑制剂处理则反而可能使乙烯的含量降低到适合的程度,从而促进紫草宁的合成。本模型虽然能很好地解释已有的研究结果,但还需进一步通过基因工程的方法对此进行深入地研究。
其他文献
有机磷光材料因为可以同时利用单线态和三线态的激子而成为开发高效率有机发光材料的热点,它的开发和应用是提高有机电致发光器件发光效率的关键途径之一。 在本文中,我们设
工作在小信号下的微波功率放大器,其相位特性的研究相对简单,仅从频域的相位线性度就可以描述;相控阵雷达中,为了增加发射信号的强度,发射通道中的功率放大器都工作在大信号、脉冲
植物考古学(Archaeobotany)是植物学与考古学的交叉生长点,主要借助植物学的研究理念和方法来研究与先民相生相伴的植物遗存,探讨古代先民的生活方式,解释人类文明的发展过程
选择东北地区地貌类型不同的4个典型县(旗),即辽宁省辽阳县和彰武县、黑龙江省嫩江县,以及内蒙古阿荣旗,基于分层不等概系统空间抽样方法抽取112个野外调查单元,进行浅沟和切
本文通过对荣华二采区10
期刊
近年来,中科院半导体所神经网络实验室从神经计算软硬件结合角度,利用我们提出的仿生模式识别技术,研究探索了一整套数学化表示、关键特征抽提和高维欧氏特征空间拟合逼近的方法
学位
光镊是基于光的物理性质实现的工具,具有非接触和非侵入性特点。在生命科学领域,凝聚态物理及原子冷却和捕获等领域光镊都是不可缺少的工具。而光学旋涡由于其独特性质在原子冷
随着计算机技术和网络的不断发展,使得网络应用从以PC为中心转向了嵌入式设备为中心,并且在工业远程控制、智能家电、农业自动化、远程报警等领域得到了广泛的应用。因此远程化
光子晶体光纤灵活的设计和特殊的导光机制,使其展现出许多普通光纤所不能比拟的奇异特性,并被广泛应用于非线性光学、医学和光通信等方面。小纤芯光子晶体光纤已成为超连续谱产
多倍体对物种进化及育种都具有重要意义,多倍体诱导是多倍体育种的基础。本研究以南林895杨(Populus×euramericana cv.‘Nanlin895’)组培苗为试验材料,在离体条件下,选择组培