视网膜母细胞瘤是具有高度侵袭性的眼部肿瘤,多见于5岁以内儿童。视网膜母细胞瘤的治疗效果依赖于早期发现和早期治疗,但由于社会经济及医疗条件的限制,很多患儿在临床的中晚期才获得诊治,疗效不佳且致盲率和致残率极高。目前对视网膜母细胞瘤的治疗主要有化疗、放疗、手术治疗及免疫治疗等,其中以化疗为基础的联合治疗是中晚期患儿最常用的方案。在临床治疗中,由于化疗药物的耐药性和毒副作用的存在,导致部分患儿难于得到及时而有效的治疗,因此需寻找毒副作用小且可负担的治疗手段或药物。三七总皂苷是从传统中药三七中提取的生物活性成分,广泛用于糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等眼科疾病的治疗。近年来在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的研究中证实三七总皂苷具有明确的抗肿瘤活性,但目前尚未发现其用于眼部肿瘤研究的报道。目的:研究三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响,以探索三七总皂苷抑制视网膜母细胞瘤的作用机制。方法:1.采用CCK-8实验分别检测三七总皂苷及卡铂对Y79细胞增殖的影响,并计算出两种药物的IC50值。参考CCK-8实验结果,实验分为阴性对照组、不同浓度（200、400、600ug/ml）三七总皂苷组及卡铂阳性对照组,使用流式细胞仪检测三七总皂苷对Y79细胞凋亡的影响,Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白表达。2.在信号通路的研究中,通过CCK-8实验分析PI3K抑制剂LY294002对Y79细胞增殖的影响并计算出IC50。检测阴性对照组和浓度梯度为200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml的三七总皂苷组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。然后按阴性对照组、三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组对Y79细胞进行分组处理,检测各组Y79细胞的凋亡情况和细胞中PI3K/AKT通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。3.使用流式细胞仪对阴性对照组、三七总皂苷组（浓度分别为200、400、600ug/ml）及卡铂阳性对照组中Y79细胞的细胞周期进行检测,应用Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因的m RNA和蛋白表达。结果:1.与阴性对照组相比,三七总皂苷可以有效抑制Y79细胞的增殖（P<0.05）,CCK-8实验结果计算出24小时、48小时及72小时三七总皂苷对Y79细胞的半数抑制浓度值（IC50）分别为429.2ug/ml;343.8ug/ml,271.5ug/ml。卡铂对Y79细胞的24小时IC50值为63.60ug/ml。三七总皂苷作用于Y79细胞后,细胞的凋亡率随药物浓度增加而升高（P<0.05）,其中600ug/ml三七总皂苷促Y79细胞凋亡的作用最明显,其细胞凋亡率为22.30±1.08%。与阴性组相比,三七总皂苷处理后的Y79细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,促凋亡蛋白的活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量也显著增加（P<0.05）,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表达则受到抑制（P<0.05）,组间对比结果显示,600ug/ml三七总皂苷对促凋亡基因的m RNA和蛋白表达的诱导作用最强（P<0.05）,对Bcl-2的m RNA和蛋白抑制作用也最明显（P<0.05）。三七总皂苷处理后的Y79细胞中Bax/Bcl-2值较阴性组明显升高（P<0.01）,600ug/ml三七总皂苷组中的Bax/Bcl-2值高于200ug/ml组（P<0.001）和400ug/ml组（P<0.005）。2.CCK8细胞增殖实验结果显示PI3K抑制剂LY294002可以有效抑制Y79细胞的增殖,其对Y79细胞的24小时IC50值为26.25umol/L。细胞凋亡检测结果显示三七总皂苷组、LY294002组及联合用药组的细胞凋亡率均高于阴性对照组（P<0.001）,联合用药组中Y79细胞的凋亡率最高,为35.59±0.85%。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内PI3K及AKT1的总蛋白表达量与阴性组相比未见差异（P>0.05）,但PI3K/AKT通路中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT（Thr308）、p-AKT（Ser473）及p-m TOR的表达量明显低于阴性对照组（P<0.05）,在三七总皂苷处理组中的磷酸化蛋白表达量随药物浓度的增加而梯度下降（P<0.05）。与阴性组相比,200ug/ml三七总皂苷对PI3K/AKT通路拮抗蛋白PTEN的表达无明显影响（P>0.05）,但400ug/ml和600ug/ml三七总皂苷组中PTEN蛋白的表达量均明显升高（P<0.01）。三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组中的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量较阴性组明显增加（P<0.05）。联合药物组中促凋亡蛋白的表达量高于三七总皂苷组和LY294002组（P<0.05）,各药物处理组细胞的Bcl-2蛋白表达量则均低于阴性组（P<0.01）,组间对比显示联合用药对Bcl-2蛋白的抑制作用最强（P<0.005）,药物处理后的Y79细胞内Bax/Bcl-2值均明显高于阴性组（P<0.005）,在联合用药组中的Bax/Bcl-2比值最高,为阴性组的2.62±0.16倍。3.按实验分组处理后,三七总皂苷各药物组处于G0/G1期的Y79细胞百分率均显著高于阴性组（P<0.01）,在600ug/ml三七总皂苷组中,G0/G1期Y79细胞所占百分比最高,为72.42±0.65%,而S期及G2/M期的细胞比例均低于阴性对照组（P<0.05）。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内G0/G1期相关基因Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达量较阴性组均明显下降（P<0.05）,并具有浓度依赖性,在600ug/ml三七总皂苷组中下降最显著（P<0.05）。结论:1.三七总皂苷能抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖、促进细胞的凋亡。2.三七总皂苷对Y79细胞的促凋亡作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而调控凋亡相关基因的表达来实现。3.三七总皂苷能通过抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达,诱导Y79细胞发生G0/G1期阻滞。