【摘 要】
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背景胃癌是我国高发恶性肿瘤,对其发生、发展的机制及改善不良预后的研究从未停止。中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）首先被发现在机体抗感染过程中发挥重要作用。而近年来多项研究证实NETs在恶性肿瘤中同样发挥特殊的作用,主要体现在促进肿瘤增殖、转移、侵袭和高凝状态。我们前期研究在胃癌组织微环境中检测出NETs的存在,发现胃癌组织微环境和外周血中
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背景胃癌是我国高发恶性肿瘤,对其发生、发展的机制及改善不良预后的研究从未停止。中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）首先被发现在机体抗感染过程中发挥重要作用。而近年来多项研究证实NETs在恶性肿瘤中同样发挥特殊的作用,主要体现在促进肿瘤增殖、转移、侵袭和高凝状态。我们前期研究在胃癌组织微环境中检测出NETs的存在,发现胃癌组织微环境和外周血中NETs含量呈正相关,并通过大样本的研究首创发现胃癌患者NETs水平可辅助诊断、预测疗效并判断预后。在其他瘤种中IL-8调控NETs释放的靶点为CXC趋化因子受体1/2（CXC chemokine receptor 1/2,CXCR1/2）,而在胃癌领域尚无该NETs上游调控机制的研究。此外胃癌患者不良预后与肿瘤细胞转录因子IIB相关因子1（BRF1）高表达和微环境内MPO阳性中性粒细胞聚集相关。胃癌组织微环境内NETs的生成和释放是否与胃癌细胞BRF1的表达相关,进而影响胃癌进展,值得进一步探索。方法通过密度离心法分离人中性粒细胞制备含有中性粒细胞的培养液,加入白细胞介素8（Interleukin 8,IL-8）、佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetat,PMA）、及粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）刺激NETs的生成,部分组别加入NETs抑制剂—脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ,DNaseⅠ）或者抗CXCR1/2抗体,通过免疫荧光检测NETs的表达情况。通过Transwell chamber assays构建中性粒细胞与胃癌细胞株的共培养体系,分组使用IL-8、PMA、G-CSF刺激,部分组别加入DNase I和抗CXCR1/2抗体,并进一步通过BALB/c鼠的肿瘤细胞移植瘤实验在体内证实其作用,通过ELISA检测小鼠外周血NE-DNA复合物反映NETs表达情况。CCK 8实验及克隆形成实验检测各处理组胃癌细胞的增殖能力,Transwell法检测各处理组胃癌细胞的侵袭和迁移能力。利用蛋白质免疫印迹及实时荧光定量PCR检测胃癌细胞株中BRF1的蛋白及m RNA表达水平;利用si RNA技术,在胃癌细胞中敲低BRF1,与各中性粒细胞处理组接触培养后通过免疫荧光检测NETs表达含量,同时通过CCK8实验及克隆形成实验检测BRF1对细胞增殖能力的影响;构建过表达BRF1的胃癌细胞,在刺激因子作用下与中性粒细胞接触培养后,通过免疫荧光检测NETs表达含量。选取小鼠MFC前胃癌细胞株进行研究,小鼠外周血中性粒细胞来源于BALB/c小鼠。针对小鼠外周血中性粒细胞和胃癌细胞的共培养体系构建及细胞功能实验方法同前述人类细胞。结果在体外通过IL-8、PMA、G-CSF能够诱导人外周血中性粒细胞形成NETs,DNaseⅠ能够破坏NETs的形成;CXCL1/2（IL-8同源物）、PMA能够诱导鼠外周血中性粒细胞形成NETs,DNaseⅠ及CXCL1/2中和抗体能够抑制NETs的形成,且DNaseⅠ组小鼠外周血NETs减少,肿瘤生长缓慢。NETs能够促进胃癌细胞株的增殖、迁移及侵袭能力。在NETs的影响下,胃癌细胞株BRF1、p21/p27蛋白表达增加,DNaseⅠ破坏NETs的形成后BRF1、p21/p27蛋白表达水平降低。利用si RNA技术构建BRF1敲低的胃癌细胞,免疫荧光显示与敲低后的胃癌细胞株共培养的中性粒细胞形成NETs减少,胃癌细胞自身的增殖能力显著降低,且p21/p27蛋白表达减少;与其相反的是,过表达BRF1的胃癌细胞株与中性粒细胞共培养后NETs表达增加,且p27、p21蛋白表达增加。CXCR1/2抗体预处理中性粒细胞组相对IL-8组NETs表达减少,且抗CXCR2组小鼠外周血NETs水平降低,移植成瘤能力降低。结论在胃癌肿瘤微环境内,IL-8通过调控中性粒细胞表面的CXCR1和CXCR2促进NETs的生成释放,进而促进胃癌的进展;而NETs可能影响胃癌细胞BRF1及周期蛋白p21/p27的表达进而影响其生物学行为,具体机制有待进一步探索;应用脱氧核糖核酸酶或CXCR1/2抑制剂等药物,能够阻止NETs的形成,消除NETs促进肿瘤转移的效应并减缓肿瘤的进展。
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