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目的本文旨在研究SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid,组蛋白去乙酰化酶抑制剂)对神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)的杀伤作用及其与MG132(a proteasome inhibitor,蛋白酶体抑制剂)的协同效应,并单独深入探讨SAHA抑制神经母细胞瘤恶性生物学行为的作用机理和分子机理。方法培养人的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,SK-N-AS,NGP和SK-N-BE2,采用CCK8和多功能实时无标记细胞分析技术检测SAHA,MG132和SAHA+MG132处理及ING5过表达细胞株的增殖情况。采用海马细胞能量代谢检测仪检测各组细胞的能量代谢情况。采用流式细胞术检测各组SH-SY5Y细胞的细胞周期改变及细胞凋亡情况。采用划痕及Transwell技术检测各组细胞的迁移和侵袭情况。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)方法检测各组细胞mRNA及蛋白水平表达改变。采用染色质免疫共沉淀(CHIP)实验验证SAHA处理及ING5过表达后,AC-H3、AC-H4和ING5蛋白对下游靶基因启动子的结合情况。采用免疫共沉淀技术检测AC-H3,AC-H4和ING5蛋白的相互作用情况。采用Double-CHIP方法检测AC-H3,AC-H4和ING5蛋白相互作用后,与下游靶基因启动子的结合情况。应用生物信息学数据库,预测和ING5基因相互结合的4种micoRNA,SAHA处理后检测4种mico-RNA的表达水平,过表达mico-RNA的mimics和inhibitor,RT-PCR检测转染效率,Western蛋白印迹方法检测过表达micoRNA的mimics和inhibitor后下游ING5基因的表达改变。应用裸鼠体外成瘤实验检测SAHA,MG132,SAHA+MG132处理及ING5过表达对裸鼠体外成瘤实验的影响;采用免疫组化检测裸鼠瘤体中AC-H3,AC-H4,ING5,p53和Ki-67等蛋白的表达改变。采用TUNEL染色方法检测不同处理组裸鼠瘤体的凋亡情况。应用免疫组化的方法检测神经母细胞瘤组织芯片中AC-H3,AC-H4和ING5的表达水平,统计分析其与神经母细胞瘤临床病理特征之间的关系。结果1、SAHA及MG132对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖活性有杀伤作用,且呈浓度及时间依赖性(P<0.05)。2、SAHA与MG132小浓度联合应用存在相互协同作用,小浓度联合应用抑制SH-SY5Y细胞的增殖,细胞能量代谢,诱导细胞周期产生G1期阻滞,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭(P<0.05)。3、SAHA处理促使神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞AC-H3,AC-H4及ING5表达增加、SAHA与MG132小浓度联合应用促进PTEN,p53,Caspase-3,Bax,p21及 p27 的表达,抑制 14-3-3,MMP-2,MMP-9,ADFP,Nanog,c-myc,CyclinD1,CyclinB1及Cdc25c的表达,且呈浓度依赖性(P<0.05)。4、ING5过表达可发挥与SAHA 一致的抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞恶性生物学行为的作用(P<0.05)。5、AC-H3,AC-H4及ING5蛋白之间存在相互作用;SAHA处理及ING5过表达促进三种蛋白的相互结合,并作用于下游启动子p21,p27,Nanog,c-myc,CyclinD1和CyclinB1的特定部位上。6、SAHA 处理及 ING5 过表达促进 p21,p27,Nanog,c-myc,CyclinD1 和CyclinB1 mRNA 的表达(P<0.05)。7、miR-640,miR-543,miR-624-3p 和 miR-196-b 与 ING5 基因的 mRNA 存在特异性结合;SAHA处理能通过抑制miR-543和miR-196-b的表达,间接促进ING5蛋白的表达。8、SAHA对神经母细胞瘤SK-N-AS,NGP和SK-N-BE2的细胞具有抑制作用(P<0.05);SAHA通过micoRNA调控ING5表达的作用机制在神经母细胞瘤中具有普遍意义。9、SAHA和MG132处理及ING5过表达能抑制裸鼠皮下成瘤。SAHA与MG132小浓度联合应用在活体内实验上也存在协同效应。SAHA和MG132处理及ING5过表达组裸鼠瘤体生长变慢,瘤体大小及重量低于对照组(P<0.05)。SAHA和MG132处理及ING5过表达处理促进瘤体中AC-H3,AC-H4,ING5和p53的表达增加,抑制瘤体增殖,促进瘤体凋亡。10、AC-H3、AC-H4和ING5在神经母细胞瘤的组织中均有表达,AC-H3,AC-H4在细胞核表达,ING5在细胞浆和细胞核表达。AC-H3和浆ING5与神经母细胞瘤肿瘤体积呈正相关(P<0.05),核ING5与神经母细胞瘤的肿瘤体积呈负相关(P<0.05)。结论1、在体内及体外实验中,SAHA和MG132处理及ING5过表达通过抑制神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、转移和能量代谢,促进凋亡和细胞周期阻滞,发挥抗神经母细胞瘤的作用。2、在神经母细胞瘤细胞中,SAHA可间接下调miR-543和miR-196-b的表达水平,间接促进ING5蛋白的表达。3、SAHA能促进神经母细胞瘤细胞中ING5的基因表达并抑制组蛋白乙酰化酶的活性,促进乙酰化组蛋白3、乙酰化组蛋白4的表达。4、乙酰化组蛋白3、乙酰化组蛋白4和ING5蛋白能相互作用,共同结合在Nanog,c-myc,Cyclin D1，p21和p27启动子的特定功能域区上。5、乙酰化组蛋白3、乙酰化组蛋白4和ING5参与神经母细瘤的发病进程。