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目的:改进一般的荧光染料法消除反应中的非特异性扩增,提高反应的特异性,并利用这种改进的荧光定量PCR定量检测大肠癌患者血浆游离DNA的MGMT和TPEF基因的甲基化状态,计算甲基化MGMT和TPEF的拷贝数。确定改进的荧光定量PCR在定量检测基因甲基化异常中的可行性。探讨MGMT、TPEF基因甲基化异常作为大肠癌早期诊断分子标记的潜在价值,及联合检测MGMT和TPEF基因的异常甲基化的意义.方法:通过对融解曲线的分析,优化荧光定量PCR的反应条件。根据亚硫酸盐修饰原理,对MGMT和TPEF基因的序列进行准确转化,人工合成的目的序列,分别构建MGMT和TPEF甲基化阳性质粒。利用构建的阳性质粒作为标准品,用改进后的荧光定量PCR法制作标准曲线。最后定量检测大肠癌患者血浆游离DNA中MGMT和TPEF基因甲基化异常,依据标准曲线计算出甲基化的MGMT和TPEF的拷贝数。结果:35例大肠癌患者血浆DNA标本中,10例为检测出有甲基化的MGMT,21例检测结果为TPEF阳性,阳性率分别为28.6%和60%,35例标本中有23例至少存在MGMT或TPEF中的一个基因甲基化,即联合MGMT和TPEF基因检测的阳性率为65.7%,并且异常甲基化MGMT基因的含量范围为:23-184拷贝/ml;甲基化TPEF基因的含量范围为:13-163拷贝/ml。结论:改进的荧光定量MSP检测MGMT和TPEF甲基化状态方法可行,结果可靠。MGMT和TPEF基因的异常甲基化均有望成为大肠癌早期诊断的表遗传标记,而且联合两者检测可提高检出率。