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目的:持续高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是引起高级别的宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变和阴道上皮内瘤变主要因素之一。这些瘤变可分别发展为宫颈癌,外阴癌和阴道癌。目前已上市的三种预防性疫苗(Cervarix,Gardasil 4和Gardasil 9)能够有效地预防HPV感染。然而它们对已经发生的HPV感染或者HPV感染引起的病变没有治疗作用。因此,迫切需要开发能够清除HPV持续感染或者HPV感染相关病变的治疗性疫苗。研究证实,细胞免疫反应是清除HPV感染和HPV感染相关病变的关键。活化的CD8+T细胞是识别和杀伤HPV感染细胞或转化的肿瘤细胞的关键效应细胞。其激活、维持及有效抗肿瘤作用需要CD4+T细胞的帮助。为保证治疗性HPV疫苗的有效性,理想的疫苗应既能诱导CD8+T细胞应答又能诱导CD4+T细胞应答。在本研究中,我们设计了一种以Candin为佐剂、以HPV16型E7多肽为抗原的新型HPV治疗性疫苗,并对该疫苗诱导的免疫应答进行了系统的评估。研究结果不仅为增强机体细胞免疫应答的人用疫苗提供重要候选佐剂,同时为开发包括宫颈癌在内的HPV感染相关疾病的全新的治疗疫苗研究奠定坚实基础。研究方法:1.多肽的合成HPV16E7蛋白由98aa组成。我们合成覆盖E7蛋白的3个多肽肽段。分别为HPV 16 E7 1-35(35aa)、HPV16 E7 36-70(35aa)和 HPV16 E7 71-98(28aa)。多肽纯度>95%。2.免疫小鼠6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组4只,分别为Candin组,E7多肽组,包含Candin和E7多肽的疫苗组,PBS对照组,并分别注射相应试剂。第3,6周各加强一次免疫。3.检测疫苗对小鼠脾细胞增殖的影响收集第8周小鼠脾。每只小鼠脾细胞分为3组,无刺激组,E7多肽刺激组和刀豆球蛋白A(concanavalinA,ConA)刺激组。MTS法检测脾细胞增殖。酶标仪检测 490nm 波长处光密度值(optical density,OD)。4.检测疫苗对小鼠HPV16 E7特异性CD4+和CD8+T细胞免疫应答的影响收集第8周小鼠脾。HPV16 E7多肽、12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA),离子霉素,蛋白转运抑制剂(brefeldinA,BFA)处理脾细胞,流式细胞术检测CD4+IFN-γ-,CD8+IFN-γ+细胞。5.检测疫苗对小鼠血清中Th1和Th2细胞因子的影响收集第8周小鼠血清,流式CBA法检测小鼠血清中Th1(IFN-γ,TNF-α,IL-2)和Th2(IL-4,IL-5)细胞因子的含量。6.检测疫苗对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群Th1,Th2,Treg细胞的影响收集第8周小鼠脾脏,流式细胞术检测Th1(CD4+ T-bet+)细胞,Th2(CD4+GATA3+)细胞,Treg(CD4+CD25+FoxP3+)细胞。7.检测疫苗诱导体液免疫应答的能力ELISA方法检测第3,6,8周小鼠血清中抗HPV16E7抗体水平。8.统计学分析应用SPSS19.0对实验数据进行统计学分析。实验结果数据均以均值±标准差表示。组间计量资料差异采用单因素方差分析的Dunnett法,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1.疫苗对小鼠脾细胞增殖的影响与PBS对照组相比,HPV16 E7多肽和疫苗能够刺激小鼠脾细胞明显增殖,Candin组没有明显变化。2.疫苗对小鼠HPV16 E7特异性CD8+和CD4+T细胞免疫应答的影响与PBS对照组相比,疫苗组小鼠脾细胞中分泌IFN-y的CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例增加。这表明疫苗可以引起HPV特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞的增殖和活化。此外,Candin组分泌IFN-γ的CD4+T细胞增多。3.疫苗对小鼠血清中Th1和Th2细胞因子的影响与PBS对照组相比,Candin组免疫的小鼠血清中IFN-γ量显著增加,疫苗组和E7多肽组则没有明显增加,疫苗组IL-2和TNF-α量的增加更为明显,但差异无统计学意义。疫苗免疫的小鼠血清中IL-5的量明显增加,但Candin组和E7多肽组的小鼠血清中的IL-5的量没有明显增加。4.疫苗对小鼠脾脏CD4-T细胞亚群Th1,Th2,Treg细胞的影响与PBS对照组相比,疫苗组和Candin组的小鼠脾细胞中Th1(CD4+T-bet-)细胞的百分比明显增加,疫苗组小鼠脾细胞中Th2(CD4+GATA3-)和Treg(CD4+CD25+FoxP3-)细胞的百分比无明显增加。5.疫苗诱导体液免疫应答的能力三次疫苗接种诱导小鼠产生HPV16 E7抗体,疫苗组的小鼠在第6周时血清抗体滴度为1:400,在第8周时血清抗体滴度达到1:12800。结论:1.Candin能够诱导Th1细胞免疫应答。2.以Candin为佐剂、HPV16 E7多肽为抗原的新型疫苗能够诱导小鼠产生HPV抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。3.该新型疫苗可以诱导小鼠产生Th1细胞免疫应答。4.该新型疫苗可以诱导小鼠产生HPV抗原特异性的体液免疫应答。