Cyr61在增殖型糖尿病视网膜病变患者玻璃体液中的表达及其对Muller细胞的作用

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目的:检测增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者玻璃体液中的富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich61,Cyr61)的含量,探讨体外培养的人Müller细胞在高糖条件下能否表达Cyr61 mRNA和蛋白,及Cyr61对人Müller细胞迁移、凋亡等影响。  方法:使用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测20名(20眼)PDR患者和12名(12眼)特发性黄斑裂孔和特发性黄斑前膜(idiopathic macular hole/idiopathic macular epiretinal membrane, IMH/IEM)患者玻璃体液Cyr61的含量。PDR患者20名作为实验组,其中PDR无视网膜脱离者10名,PDR伴视网膜脱离者10名;特发性黄斑裂孔或特发性黄斑前膜患者12名作为对照组。在基因水平,通过RT-qPCR(real time-qPCR)技术,检测人Müller细胞在高糖条件下(5、10、20 mM)是否表达Cyr61 mRNA,进而检测人Müller细胞在不同时间(4、6、8、24 h) Cyr61 mRNA的表达。在蛋白水平,通过western blot技术,检测人Müller细胞在高糖条件(5、10、20 mM)是否表达Cyr61蛋白。将浓度分别为0、10、30、100、300 ng/mL的Cyr61分别加入人Müller细胞中培养24 h和48 h,通过MTT比色法检测Cyr61对人Müller细胞存活率的影响。通过Transwell技术,观察不同浓度Cyr61(0、3、10、30、100、300 ng/mL)对人Müller细胞迁移的影响。再通过TUNEL实验,检测不同浓度Cyr61(0、30、300 ng/mL)对人Müller细胞凋亡的影响。  结果:  1.ELISA结果显示:PDR组玻璃体液Cyr61的含量(3576.92±1574.58pg/mL)显著高于对照组(436.14±130.69 pg/mL),差异具有统计学意义(Mann-Whitney U test,P=0.002)。实验组中,PDR不伴有视网膜脱离组玻璃体液Cyr61含量为4988.90±1058.80 pg/mL,比PDR伴有视网膜脱离组Cyr61含量(2341.43±509.44 pg/mL)高2倍多,两组相比,差异有统计学意义(Mann-Whitney U test,P=0.013)。  2.RT-qPCR结果显示:Cyr61 mRNA在10 mM糖浓度时开始增高,当糖浓度为20 mM时,Cyr61 mRNA表达最高,呈在剂量依赖模式,糖的剂量越高,其刺激人Müller细胞Cyr61 mRNA表达效果越明显。进一步发现Cyr61 mRNA在高糖(10 mM)刺激人Müller细胞8h开始增高,在24h时Cyr6 mRNA表达最高,呈时间依赖模式,刺激时间越长,人Müller细胞表达Cyr61 mRNA效果越显著。  3.Western blot结果显示:Cyr61蛋白在10 mM糖浓度时开始增高,20 mM时达到高峰,也呈在剂量依赖模式,糖的剂量越高,其刺激人Müller细胞表达Cyr61蛋白效果越明显。  4.MTT结果显示:人Müller细胞在不同浓度Cyr61(0、10、30、100、300ng/mL)培养24 h时,人Müller细胞存活率在Cyr61浓度为100 ng/mL时开始下降,随着Cyr61浓度增大,Müller细胞存活率越低。当在培养48 h时,人Müller细胞存活率在Cyr61浓度为10 ng/mL时开始下降,随着Cyr61浓度增大,Müller细胞存活率越低。均呈剂量依赖模式。  5.Transwell结果显示:不同Cyr61浓度(0、3、10、30、100、300 ng/mL)刺激人Müller细胞,Cyr61浓度为3 ng/mL Müler细胞迁移增加,当30 ng/mL对Müller细胞的迁移作用开始抑制。  6.不同浓度人Cyr61重组蛋白培养Müller细胞,Cyr61剂量越大,Müller细胞的凋亡越明显。  结论:  1.增殖性糖尿病视网膜病变的患者玻璃体液中Cyr61的浓度较高,说明在糖尿病视网膜病变的发生发展中Cyr61起着一定的作用。  2.人Müller细胞在高糖的培养下,在基因和蛋白水平均能表达Cyr61。  3.Cyr61对人Müller细胞有促凋亡作用。
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