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牙周炎是口腔常见病、高发病,可引起牙周组织降解、牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收,最终导致牙齿松动脱落或被拔除,是成人牙齿丧失的首要原因。吸烟者牙周炎的患病率高、病情重、治疗效果和预后差,其具体机制却不清楚。现已证实,尼古丁作为烟草中的主要毒性物质,在吸烟对牙周组织的破坏过程中发挥重要作用。然而,尼古丁究竟通过何种途径对牙周组织产生破坏作用,目前尚不明了。课题组前期研究表明,体外培养人牙周膜细胞中功能性表达α7 nAChR;本人前期研究发现大鼠牙周组织中存在尼古丁靶受体:α7型尼古丁乙酰胆碱受体(alphaα7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)的mRNA和蛋白表达,尼古丁可明显上调该受体的表达,且α7 nAChR表达调节与大鼠牙周组织破坏、牙槽骨吸收程度密切相关。然而,尼古丁激活α7 nAChR后如何对牙周组织产生破坏作用?其分子机制是什么?目前尚未见相关报道。目的:本课题采用尼古丁作用下人牙周膜细胞和实验性牙周炎大鼠为模型,观察α7 nAChR对体外培养人牙周膜细胞增殖、贴附与迁移等生物学特性的调控,以及对牙周膜细胞和牙周组织分泌牙周炎相关炎性介质的影响,并进一步筛选和探明α7 nAChR激活后下游关键分子信号通路,以期阐明α7 nAChR在吸烟促进牙周炎发生发展中所扮演的角色及其作用机制。材料与方法:体外研究,培养人牙周膜细胞,并分别给予α7 nAChR激动剂尼古丁(0.1-10μM)和/或拮抗剂-银环蛇毒素( -bungarotoxin, -BTX, 10nM);及ERK1/2信号通路抑制剂U0126(10μM)、P38信号通路抑制剂SB203580 (10μM), JNK信号通路抑制剂SP600125(10μM)和PI3K信号通路抑制剂LY-294,002(10-5μM)处理。分别采用WST-1、贴附实验和划痕修复实验测定细胞增殖、贴附与迁移能力改变;采用实时定量PCR、免疫荧光染色和Western blot等实验检测各组细胞α7 nAChR、IL-1?、IL-6、TNF-、RANKL和OPG等基因和蛋白表达,及ERK1/2和p-ERK1/2等磷酸化信号通路蛋白表达情况。体内研究,24只SD大鼠采用两次完全随机分组方法分为4组,每组6只;采用3-0丝线结扎上颌左侧或右侧第二磨牙颈部,对侧不予结扎,作为自身对照;次日起分别给予生理盐水、尼古丁1.62 mg/kg/d、-BTX 10μg/kg/d、-BTX(10μg/kg/d)+30分钟后尼古丁(1.62 mg/kg/d)腹腔注射,常规饲养。全部大鼠于结扎前行麻醉下活体显微CT头部扫描,并分别于给药后α7、14、21和28天行活体显微CT头部扫描;采用Tri-Bon影像分析系统,重建各组大鼠颅颌面及牙体牙周组织影像;采用严格的标准化定位方法,创建一种基于“四根定位”的新型牙槽骨定量分析策略;定量分析各组大鼠牙槽骨骨密度、骨小梁厚度、骨体积分数等参数的动态改变;各组大鼠于给药后28天取材,解剖取出双侧上颌磨牙区组织,制作牙体牙周联合切片;HE染色进行病理学观察;免疫组织化学检测各组大鼠牙周组织α7 nAChR、IL-1?、IL-6、TNF-等蛋白表达情况。结果:体外研究,实时定量PCR结果表明,10μM尼古丁作用下人牙周膜细胞α7 nAChR基因表达明显上调,约为对照组的4.α7倍(P < 0.001);-BTX +尼古丁处理组α7 nAChR基因表达水平与对照组近似,差异无统计学意义;免疫荧光染色和Western blot结果证实,体外培养正常人牙周膜细胞中α7 nAChR蛋白呈阳性表达;与对照组相比,尼古丁处理组α7 nAChR表达增强, -BTX预处理可拮抗尼古丁对α7 nAChR表达的上调作用;α7 nAChR激活可抑制细胞增殖和贴附,而促进其迁移。体内研究,尼古丁作用下大鼠α7 nAChR表达明显上调,与之相对应的是,牙槽骨吸收亦明显加重,而-BTX预处理可拮抗尼古丁的作用;尼古丁单独作用下,大鼠牙槽骨显微结构呈现慢性破坏,其特征为首先出现骨小梁厚度降低且骨小梁分离度升高,后期出现骨体积分数和骨小梁数目降低;尼古丁给药结合丝线结扎可造成大鼠牙槽骨急剧丧失。体内和体外研究均显示,尼古丁作用下人牙周膜细胞或大鼠牙周组织中α7 nAChR表达上调的同时,IL-1?、IL-6、TNF-和RANKL表达亦明显增强且OPG表达减弱;而ERK1/2和PI3K信号通路抑制剂可显著降低IL-1?、IL-6和TNF-的表达;尼古丁作用下人牙周膜细胞ERK1/2磷酸化水平明显增高。结论:本研究证实α7 nAChR在体外培养人牙周膜细胞中存在功能性表达;发现尼古丁可通过作用于α7 nAChR调节牙周膜细胞增殖、贴附和迁移等生物学特性;人牙周膜细胞α7 nAChR激活后可通过作用于下游ERK1/2和PI3K信号通路影响IL-1?、IL-6和TNF-等炎性细胞因子分泌而参与牙周组织的炎症反应和牙槽骨吸收过程;大鼠牙周组织α7 nAChR激活可通过特定模式动态调控牙槽骨的显微结构改变。本研究表明尼古丁可通过作用于α7 nAChR而激活下游ERK1/2和PI3K信号转导通路,从而参与吸烟相关性牙周炎的发生和发展。