背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后的迟发性缺血性神经功能缺损(delayed ischemic neurological deficit, DIND)是动脉瘤性SAH患者致死或致残的主要原因之一,也是创伤性SAH患者预后不良的重要因素。2004年Zhang等提出了SAH后早期脑损伤(early brain injury,EBI)的概念,认为血脑屏障通透性的改变、脑水肿、颅内压升高、脑组织微环境的改变共同参与了EBI的形成,但目前还缺乏SAH后DIND的研究。没有理想的动物模型是阻碍DIND深入研究的重要原因。活血化瘀中药牛膝的有效成分蜕皮甾酮(Ecdysterone,EDS)是一种类固醇样激素,已有的一些研究提示,它对血管内皮细胞有一定保护作用。我们前期实验证实应用EDS能减轻血性脑脊液造成的脑血管内皮细胞损伤,减轻血管平滑肌细胞和外膜成纤维细胞的增殖作用。但在体情况下,EDS是否能对实验性SAH继发神经损害有治疗作用,还缺乏相关的研究。目的:建立有明显神经症状的家兔SAH模型,观察SAH后实验动物神经行为学的变化及继发性脑损伤的病理特征,探讨海马细胞间液能量代谢、谷氨酸、海马PI3K通路、TUNEL染色的变化特征,并结合观察EDS对实验性家兔SAH继发神经损害的干预效果,为EDS用于SAH后继发性神经损害防治提供实验依据。方法:1.采用雄性家兔结扎右侧颈总动脉后7d首次枕大池注入自体动脉血,此后48h二次注血的方法,建立家兔蛛网膜下腔出血后症状性SAH模型;2.实验动物随机分为:正常对照组(N组)、结扎右侧颈总动脉组(L组)、枕大池二次注血组(SAH组)、结扎后枕大池二次注血组(L-SAH组)、结扎后枕大池二次注血尼莫地平治疗组(Nim/SAH组)、结扎后枕大池二次注血EDS(1mg/kg,4次/d)治疗组(EDS/SAH 1mg组)、结扎后枕大池二次注血EDS(3mg/kg,4次/d)治疗组(EDS/SAH 3mg组);3.采用Strong行为学评分研究各组家兔SAH后行为学变化;4.用激光多普勒血流仪(LDF)检测双侧顶叶脑皮层局部脑血流(rCBF);5.采用立体定向下细胞外记录的方法记录各组动物海马神经元单位放电,反应海马神经元功能变化;6.用微透析技术监测家兔SAH后海马区细胞间液葡萄糖、乳酸、丙酮酸、乳酸/丙酮酸比值、谷氨酸含量的变化;7.用脑含水量测定反应家兔SAH后脑水肿情况;8.通过光镜及透射电镜观察实验性家兔海马及基底动脉的病理形态学变化;9.采用免疫组化的方法研究SAH后家兔海马组织中Bax、Bcl-2的表达情况,以及TUNEL染色反应SAH后家兔海马神经元凋亡样改变;10.用RT-PCR、Western blot检测海马组织PI3K的表达变化。结果:1.家兔右侧颈总动脉结扎后枕大池穿刺二次注血后能成功建立家兔SAH后症状性脑血管痉挛的模型,且死亡率为25%;2.从行为学观察,L组家兔没有明显的行为学异常,行为学评分均为0;SAH组家兔SAH后1-7d行为学评分分别为4.17±1.17,5.33±1.63,4.67±1.37,4.00±0.89,2.50±0.55,1.83±0.41,1.50±0.55,其中SAH后1-4d较L组明显上升(P<0.01),SAH后5d开始回落,但较L组仍升高(P<0.05),7d明显下降;L-SAH组家兔SAH后1-7d行为学评分分别为6.00±1.79,8.00±1.90,8.00±2.37,6.50±1.97,4.33±1.63,3.00±1.10,2.17±0.75,SAH后1-7d行为评分均较L组明显升高,在SAH后2d、3d以及5-7d行为学评分较SAH组高,其中3d、5d、6d更为明显(P<0.01)。采用Nim和EDS治疗后家兔的行为学评分有下降,Nim/SAH组SAH后1-7d的行为学评分分别为4.67±1.21,5.83±1.17,4.83±0.98,4.50±1.05,2.50±0.55,2.33±0.52,2.00±0.00,较L-SAH组降低,其中2-5d更明显(P<0.01);EDS/SAH 1mg组SAH后1-7d行为学评分为4.67±1.21,5.50±0.84,4.83±0.98,4.33±0.82,2.33±0.52,1.67±0.52,1.50±0.55,较L-SAH组下降,其中2-6d显著降低(P<0.01);EDS/SAH 3mg组SAH后1-7d行为学评分为4.16±0.75,5.17±0.75,4.83±1.17,4.17±0.75,2.50±0.55,1.67±0.52,1.33±0.52,其中SAH后2-7d较L-SAH组下降,SAH后7d较Nim/SAH组有所下降(P<0.05)。3.各组结扎右侧颈总动脉前后及左右两侧rCBF均无显著明显差别。SAH组SAH后30min、1d、3d、7d左右两侧相对rCBF分别为60.63±7.76%(左)、62.33±7.88%(右)、83.92±10.07%(左)、82.73±7.55%(右)、95.07±5.82%(左)、91.83±6.39%(右)、98.28±7.95%(左)、92.07±4.39%(右),SAH后1d内rCBF明显降低(P<0.01),到注血后3d逐渐回升。L-SAH组在SAH后rCBF也明显下降,SAH后30min、1d、3d、7d左右两侧相对rCBF分别为57.30±6.90%(左)、58.22±10.69%(右)、83.53±5.00%(左)、83.20±6.46%(右)、92.57±4.36%(左)、93.60±13.52%(右)、91.57±5.13%(左)、97.30±5.63%(右),SAH后30min以及1d较L组均明显下降(P<0.01),3d、7d L-SAH组左侧rCBF较SAH组下降(P<0.05)。Nim/SAH组SAH后30min、1d、3d、7d相对rCBF值分别为58.97±10.69%、60.47±7.84%、91.98±5.55%、94.57±6.06%、98.82±7.70%、99.50±9.63%、101.68±12.79%、102.80±9.85%;EDS/SAH 1mg组SAH后30min、1d、3d、7d相对rCBF值分别为61.58±8.39%、57.93±7.87%、91.73±4.35%、92.27±4.99%、94.15±5.82%、95.07±5.82%、99.82±10.31%、97.55±10.71%;EDS/SAH 3mg组SAH后30min、1d、3d、7d相对rCBF值分别为62.82±7.35%、58.38±7.50%、91.88±4.50%、92.30±4.77%、94.32±6.22%、95.63±5.54%、100.30±10.08%、97.62±11.28%,其中三治疗组在SAH后1d较L-SAH组上升(P<0.01)。4.各组各部位SAH后3d脑含水量(BWC)比较N组与L组无明显差别(P>0.05),SAH组左侧和右侧大脑皮层BWC较N组和L组上升,左侧海马BWC较N组有所上升(P<0.05);L-SAH组家兔也明显上升,双侧大脑皮层及海马、小脑和脑干分别为80.45±0.47%、80.37±0.50%、81.93±0.44%、81.93±0.65%、79.32±0.88%、72.65±0.87%,左右侧大脑皮层和海马较N、L和SAH组均明显上升(P<0.01)。整个脑组织脑含水量观察:L组、L-SAH组、Nim/SAH组、EDS/SAH 1mg组、EDS/SAH 3mg组分别为77.7±0.35%、78.56±0.52%、78.56±0.53%、78.29±0.40%、78.06±0.52%,其中L-SAH和Nim/SAH组较L组明显升高(P<0.01),而EDS/SAH 3mg组较L-SAH组降低(P<0.05)。5. L-SAH组光镜及投射电镜均证实海马组织SAH后出现了缺血表现,主要是核周间隙增宽,轴突水肿; SAH后基底动脉血管壁各层均出现一定程度的病理改变,主要表现为内皮细胞破坏、平滑肌结构紊乱、血管褶皱以及管径缩小,以上变化较SAH组和治疗组更为明显。6. SAH后,各组家兔海马脑组织细胞间液中微透析测定各物质的浓度左右两侧均无显著差异(P>0.05),各组各时相点的葡萄糖浓度无明显的统计学意义。乳酸浓度SAH后升高,左侧海马乳酸浓度在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为3.48±1.63mmol/l,7.00±2.76 mmol/l,7.11±2.17 mmol/l,4.52±1.58 mmol/l,其中SAH后1d较SAH前显著升高(P<0.01);右侧海马乳酸浓度在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为3.55±2.4 mmol/l,6.66±2.90 mmol/l,7.18±2.33 mmol/l,4.59±1.91 mmol/l,其中SAH后1d和3d均较基础值升高(P<0.05),至第7d时乳酸水平有所回落,较SAH后3d时有差异(P<0.05)。丙酮酸SAH后明显降低,左侧海马丙酮酸浓度在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为122.47±18.32μmol/l , 94.32±19.23μmol/l , 84.85±16.59μmol/l,84.93±30.46μmol/l,其中SAH后1d降低(P<0.05),SAH后3d和7d显著降低(P<0.01),右侧海马丙酮酸浓度SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为125.23±16.62μmol/l,97.07±38.94μmol/l,92.35±17.79μmol/l,80.87±25.90μmol/l,其中SAH后3d和7d也较SAH前降低(P<0.05)。L/P比值在SAH后明显上升,左侧海马L/P在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为29.31±15.24, 72.74±21.36,83.42±16.81, 55.79±17.95,其中SAH后1d和3d较SAH前显著上升(P<0.01),7d有所下降但仍较SAH前高(P<0.05);右侧海马L/P在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为27.97±14.16,70.57±24.40,78.58±23.18,58.72±20.58,其中SAH后1d和3d比较明显(P<0.05)。SAH后谷氨酸浓度显著上升,左侧海马谷氨酸浓度在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为9.61±7.27 mmol/l,106.07±42.61 mmol/l,52.97±26.10 mmol/l,45.02±57.47 mmol/l,其中SAH后1d较SAH前显著升高,3d和7d有所下降,较SAH1d时有差异(P<0.05);右侧海马谷氨酸浓度在SAH前、SAH后1d、3d和7d分别为12.00±8.82 mmol/l,110.56±31.68 mmol/l, 57.30±24.15 mmol/l,34.43±30.46 mmol/l,其中SAH后1d和3d较SAH前显著升高(P<0.01),而3d和7d较1d明显降低(P<0.01)。EDS/SAH 3mg组右侧海马组织间液中L/P比值在SAH后3d时较其它组低(P<0.05)。Nim/SAH组1d和3d右侧海马组织间液谷氨酸含量较L-SAH组降低(P<0.05),EDS/SAH 1mg组家兔右侧海马组织间液谷氨酸含量较L-SAH组也有所降低(P<0.05),EDS/SAH 3mg组较L-SAH组和Nim/SAH组均明显降低(P<0.01)。7. L-SAH组Bax染色较强,而Bcl-2染色较浅;三组治疗组与之相反。L-SAH组海马组织中有较多TUNEL染色阳性的细胞,而治疗的家兔阳性细胞不明显。8. RT-PCR、Western blot结果显示L-SAH组家兔海马SAH后3d PI3K mRNA和蛋白与β-actin比较,表达下降。治疗组PI3K mRNA和蛋白表达有所上升,EDS/SAH 3mg组更明显。结论:1.右侧颈总动脉结扎后枕大池穿刺二次注血法可以建立家兔症状性蛛网膜下腔出血模型,该SAH模型制备后双顶部脑皮层血流量下降,脑含水量增高;2.右侧颈总动脉结扎后枕大池穿刺二次注血家兔蛛网膜下腔出血后家兔出现海马能量代谢紊乱,细胞间液中谷氨酸堆积增加,海马组织中TUNEL阳性细胞增加;3.右侧颈总动脉结扎后枕大池穿刺二次注血家兔蛛网膜下腔出血后海马组织出现明显的胶质细胞水肿、血管周围间隙(VRS)增宽等缺血性改变;基底动脉也出现管径缩小、血管壁增厚、内皮细胞破坏、平滑肌细胞结构紊乱等表现;4. RT-PCR和Western blot表明PI3K在SAH后海马组织中表达呈下降趋势;5. EDS治疗对SAH家兔神经功能评分有一定改善作用,能在一定程度上改善SAH后局部脑血流,降低脑含水量,减少家兔SAH后海马组织的能量代谢障碍、细胞间液谷氨酸的堆积、TUNEL阳性细胞数量下降、PI3K表达上升,并有一定的量效关系。