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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种具有高度传染性的病毒性疾病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。CSFV对免疫系统的细胞有很强的亲和力,能够在巨噬细胞和树突状细胞中复制,并且引起细胞的一些抗病毒反应。病毒在它们生命周期的各个阶段都会与细胞膜上的脂质相互作用并调节脂质的代谢,这样能够帮助它们入侵、复制装配以及病毒的释放。本文主要围绕猪瘟病毒对IL-1β的释放以及胆固醇在猪瘟病毒感染中的作用展开了研究,获得了以下结果:(1)应用实时荧光定量PCR、ELISA等方法,证明猪瘟病毒感染能够诱导IL-1β的释放,Western blot检测发现猪瘟病毒感染后能够活化caspase-1,利用caspase-1的抑制剂证明猪瘟病毒是通过活化caspase-1来诱导IL-1β的释放。活性氧(ROS)在IL-1β的释放过程中起到了一定的作用,利用ROS探针发现猪瘟病毒感染能够上调巨噬细胞中ROS水平,并用ROS抑制剂PDTC证实了ROS并不参与猪瘟病毒诱导的IL-1β的释放。(2)提取CSFV感染的细胞总RNA,以反转录的c DNA为模板扩增得到CSFV p7基因的全长序列为210 bp,根据p EGFP-C3质粒图谱,成功构建了重组真核表达质粒p EGFP-p7并经过酶切和测序鉴定。将获得的阳性质粒通过转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)与猪巨噬细胞,G418(1500μg/m L)筛选等过程,经RT-PCR和Western blot鉴定后,成功得到了稳定表达CSFV p7蛋白的细胞株。后续的研究发现CSFV p7蛋白能够诱导IL-1β的释放,并且这种作用能够被离子通道抑制剂金刚烷胺所抑制。另外,利用蛋白酶体抑制剂MG132的作用,发现CSFV p7蛋白在不同的细胞系中都是一种不稳定的蛋白,会快速地通过蛋白酶体途径降解,而通过抑制降解发现,CSFV p7蛋白的增加会促进IL-1β的释放。研究结果为猪瘟病毒诱导的炎症反应机制提供了理论依据。(3)用胆固醇去除剂MβCD先孵育细胞1h来去除细胞膜上的胆固醇,然后感染猪瘟病毒,发现胆固醇的耗竭能够抑制猪瘟病毒入侵细胞,而且这种效果与MβCD剂量呈正相关。同样地,先用猪瘟病毒感染细胞,然后用MβCD去除细胞膜上胆固醇,发现胆固醇的耗竭同样能够抑制CSFV的复制增殖。为了验证MβCD对猪瘟病毒感染产生的影响是否为可逆的,进行了外源性胆固醇添加试验,发现添加外源性胆固醇能够部分中和MβCD处理对CSFV感染的影响。(4)将MβCD与猪瘟病毒混匀作用1h,用来去除猪瘟病毒囊膜上的胆固醇,为了排除药物的影响,将混合物稀释100倍后感染细胞。结果发现去除病毒囊膜上的胆固醇大大降低了猪瘟病毒的感染力。为了补充病毒囊膜上的胆固醇,添加了外源性的胆固醇到MβCD处理过的猪瘟病毒中作用1h,稀释100倍后再去感染细胞,发现添加了外源性胆固醇能够部分恢复猪瘟病毒的感染性。(5)通过实时荧光定量PCR和Western blot检测发现猪瘟病毒感染能够上调caveolin-1的表达。利用sh RNA,通过转染,嘌呤霉素的筛选(4μg/m L)以及鉴定,成功获得了一株能够干扰caveolin-1的细胞株。结果表明,干扰caveolin-1后,猪瘟病毒的复制增加了。说明caveolin-1介导的内吞作用在猪瘟病毒入侵细胞中并不起作用。综上所述,本研究通过试验发现CSFV能够通过激活caspase-1来诱导IL-1β的表达以及成熟,而ROS并不参与其中。进一步试验发现CSFV p7蛋白能诱导IL-1β的表达,而且这种作用能被离子通道抑制剂金刚烷胺抑制。研究结果为CSFV诱导的炎症反应机制提供了理论依据。此外,通过胆固醇去除试验发现细胞膜上胆固醇的耗竭不仅能够抑制CSFV的入侵,在CSFV的复制阶段也起了一定的作用,添加外源性的胆固醇能够部分中和这种效果。后续的试验发现CSFV感染能够上调caveolin-1的表达,干扰caveolin-1后CSFV的增殖会增加,证明CSFV入侵细胞并不是通过caveolin-1介导的内吞,这为阐明脂筏在CSFV生命周期中的作用提供了一定的理论依据。