胶质母细胞瘤是中枢神经系统肿瘤中发病率最高且恶性程度最高的肿瘤,患者生存期短,手术疗效差,术后极易复发,并且对放化疗等多种治疗手段耐受。因此,找到有效的治疗策略,不仅可以有效的杀灭肿瘤细胞,抑制肿瘤复发,并且可以改善患者的预后。FTY720是新近开发的一种免疫抑制剂,有文献报道其在体内、体外都有明确的抗肿瘤作用。FTY720不仅可以诱导肝细胞癌的凋亡、抑制肝细胞癌的侵袭和转移而且可以抑制裸鼠体内实体肿瘤的生长。并且在前列腺癌中,FTY720除了诱导线粒体凋亡外还增加了肿瘤细胞对放疗的敏感性。此外,在胃癌、卵巢癌中,FTY720也有明确的抗肿瘤作用,但其具体的作用机制尚不明确。磷酯酰肌-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)家族参与多种信号通路。PI3K-蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)信号通路包括PI3K、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin, mTOR)及p70S6K等分子。PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路与正常细胞分化密切相关,该通路的异常活化在肿瘤的发生发展中起着十分重要的作用。研究表明,该通路与肿瘤细胞的生物学行为如凋亡、自噬、侵袭和转移等有着密不可分的联系。因此,我们推测FTY70是否通过PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路在胶质母细胞瘤中发挥抗肿瘤的作用。我们通过体内体外两种模型,研究FTY720对胶质母细胞瘤凋亡、坏死、自噬、侵袭与迁移的影响以及PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路在其中的作用。本课题共分成以下五个研究部分：第一部分FTY720对胶质母细胞瘤凋亡和坏死的影响目的：建立各种胶质母细胞瘤细胞系模型,完善细胞的培养和传代的方法。研究FTY720对胶质母细胞瘤凋亡和坏死的影响,同时区分FTY720诱导的凋亡是内源性凋亡还是外源性凋亡。探索FTY720在胶质母细胞瘤治疗中的潜在价值。方法：建立U251MG和U87MG胶质母细胞瘤细胞系模型以及鼠和人原代神经元模型,分别按照浓度梯度和时间梯度加入FTY720,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测FTY720对肿瘤细胞有无杀伤作用。用二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide, DMSO)或者15μMFTY720作用肿瘤细胞12小时后,通过Annexin V和propidium iodide (PI)染色判断FTY720能否诱导肿瘤细胞的凋亡或者坏死。肿瘤细胞用15μM FTY720作用不同的时间(0,3,6,12 h)或者用不同浓度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小时后,通过Western blot检测凋亡相关蛋白(caspase-3、poly (ADP-ribose) polymerase (PARP))和坏死相关蛋白(receptor-interacting protein 1、receptor-interacting protein 3 (RIP1、RIP3))的表达变化。肿瘤细胞用不同浓度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小时后,通过蛋白印迹电泳(Western blot)区分FTY720诱导的凋亡是外源性凋亡(标志物：caspase-8)还是内源性凋亡(标志物B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)、B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL)、Bcl-2-associated X protein (Bax)、细胞色素c(cytochrome c))。结果：FTY720对U251MG和U87MG有明确的杀伤作用。Western blot结果显示FTY720可以诱导凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的裂解和坏死相关蛋白RIP1、RIP3的表达,提示FTY720可以诱导胶质母细胞瘤的凋亡和坏死。此外,FTY720作用后,外源性凋亡的标志物裂解的caspase-8的表达显著升高,而内源性凋亡的标志物Bcl-2、Bcl-xL、Bax和cytochrome c未见明显变化,表明FTY720诱导的凋亡为外源性凋亡而非内源性凋亡。结论：FTY720可以诱导胶质母细胞瘤外源性凋亡和坏死。第二部分FTY720对胶质母细胞瘤自噬的影响以及自噬在FTY720诱导的凋亡和坏死中的作用目的：研究FTY720能否诱导胶质母细胞瘤的自噬以及FTY720诱导的自噬和凋亡以及坏死的关系。方法：肿瘤细胞用15μMFTY720作用不同的时间(0,3,6,12h)或者用不同浓度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小时后,通过Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)、Beclin 1、自噬相关基因3(autophagy related 3, Atg3)、自噬相关基因5(autophagy related 5, Atg5)、自噬相关基因7(autophagy related 7, Atg7)、自噬相关基因12 (autophagy related 12, Atgl2)的变化。肿瘤细胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,用抗LC3的一抗染色后再用相应的荧光二抗染色,最后通过免疫荧光观察FTY720作用后肿瘤细胞内自噬点(LC3一般散在于细胞中,自噬体形成过程中,LC3会聚集于自噬体的表明,形成高亮的自噬点,通过LC3免疫染色可以观察到)的变化。肿瘤细胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,通过透射电镜观察肿瘤细胞内自噬体的形成。肿瘤细胞在DMSO或者15μMFTY720作用后,再经吖啶橙(acridine orange, AO)染色,最后通过荧光显微镜观察肿瘤细胞内自噬溶酶体的形成。细胞用不同浓度的FTY720作用12小时,通过Western blot检测p62蛋白的变化。肿瘤细胞先用10 nM巴伐洛霉素Al (Bafilomycin Al, BafA1)作用1小时后再和15μMFTY720共同作用12小时,通过Western blot检测p62和LC3蛋白的变化。肿瘤细胞用15μMFTY720和3 mM3-MA共同作用12小时后,用CCK-8检测细胞存活率的变化,并且通过Western blot检测使用FTY720和3-MA共同作用后自噬相关蛋白(LC3)和凋亡相关蛋白(caspase-8、caspase-3和PARP)的变化。肿瘤细胞先用Beclin 1 short hairpin RNA(shRNA)作用72小时后再加入15μMFTY720共同作用12小时,分别用CCK-8和Western blot观察细胞存活率和凋亡相关蛋白(PARP)的变化。通过流式细胞仪检测抑制自噬后(3-MA和下调Beclin 1后)凋亡(Annexin V)和坏死(PI)的变化。结果：FTY720作用后胶质母细胞瘤细胞系U251MG和U87MG内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg3、Atg5、Atg7、Atg12的表达升高；免疫荧光分析提示FTY720作用后肿瘤细胞内自噬点明显增多：透射电镜观察到FTY720作用后细胞内有自噬体形成；FTY720作用后细胞内自噬溶酶体的数量明显增多；FTY720抑制了p62的表达,且使用自噬抑制剂BafA1后进一步存进了p62的减少和LC3-II的增多。使用自噬抑制剂3-MA后FTY720诱导的U251MG和U87MG的细胞死亡明显减少。此外,3-MA能减少FTY720诱导的LC3的转化,caspase-8、caspase-3和PARP的裂解。慢病毒下调Beclin 1的表达后,FTY720诱导的细胞凋亡也明显减少了。流式细胞仪同样检测到抑制自噬后FTY720引起的Annexin V和PI阳性的细胞数量明显减少,表明抑制自噬可以抑制FTY720诱导的胶质母细胞瘤细胞系的凋亡和坏死。结论：FTY720能显著诱导胶质母细胞瘤自噬并且FTY720诱导的自噬促进了胶质母细胞瘤凋亡和坏死。第三部分FTY720对胶质母细胞瘤侵袭与迁移的影响目的：研究FTY720能否抑制胶质母细胞瘤的侵袭和迁移。方法：培养胶质母细胞瘤细胞系U251MG和U87MG并种植于96孔板中。将FTY720分为0 μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6 μmol/L、7 μmol/L、8μmol/L九个浓度梯度组,分别加入至各孔中作用24小时后进行CCK-8增殖实验,确定FTY720的给药时间和浓度梯度。通过CCK-8增殖实验确定FTY720的给药时间和浓度梯度(24小时,0、1.5、3、6μmol/L)后进行细胞划痕实验,研究FTY720能否抑制胶质母细胞瘤的迁移;进行Trans well侵袭与转移实验研究FTY720能否抑制胶质母细胞瘤的侵袭和迁移；肿瘤细胞用不同浓度的FTY720(0,1.5,3 and 6 μM)作用24 h后通过Western blot观察FTY720能否改变促进侵袭和迁移(matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9)与抑制侵袭和迁移(tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), TIMP-2)蛋白的表达。最后,肿瘤细胞用不同浓度的FTY720作用后,通过Western blot研究FTY720能否改变上皮间质转化相关因子(epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-related factors)如roundabouts-1 (ROBO-1), Rhoassociated kinase-1 (ROCK-1), N-cadherin, E-cadherin和、imentin的表达。结果：FTY720的给药时间和浓度梯度分别为24h,0、1.5、3、细胞划痕实验和Transwell侵袭与迁移实验显示FTY720能够显著抑制胶质母细胞瘤的侵袭和迁移；FTY720能够下调MMP-2, MMP-9并上调TIMP-1, TIMP-2的表达;FTY720能够抑ROBO-1,ROCK-1,N-cadherin,vimentin并促进E-cadherin的表达。结论：FTY720能够显著抑制胶质母细胞瘤的侵袭和迁移。第四部分PI3K/AKT/mTOR信号通路在FTY720引起的胶质母细胞生物学行为变化中的作用目的：研究FTY720是否通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路来诱导白噬、抑制侵袭和转移。方法：肿瘤细胞用15μMFTY720作用不同的时间(0,3,6,12h)或者用不同浓度的FTY720 (0,3.75,7.5,15μM)作用12小时后,通过Western blot检测FTY720作用后细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路及其下游信号p70S6K的蛋白变化。肿瘤细胞先用10 μM PI3K抑制剂LY294002作用1,小时后再和FTY720共同作用,通过Western blot检测p-AKT,AKT,LC3,MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的表达变化。结果：FTY720显著抑制肿瘤细胞内AKT,mTOR和p70S6K的磷酸化水平,而对肿瘤细胞内总的AKT,mTOR和p70S6K无明显影响,表明FTY720抑制了PI3K/AKT/mTOR/p70S6K言号通路的活性；使用PI3K抑制剂LY294002和FTY720共同作用后,细胞内LC3-Ⅱ, TIMP-1和TIMP-2的表达进一步增多,而MMP-2，MMP-9的表达进一步减少。结论：FTY720通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来诱导自噬和抑制侵袭、转移的。第五部分FTY720对胶质母细胞瘤裸鼠种植模型的影响目的：研究FTY720能否在裸鼠体内成瘤模型中发挥抗肿瘤的作用。方法：将U251MG和U87MG以5.0×106细胞/裸鼠的密度悬浮于100μl磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution, PBS)中,然后植入裸鼠皮下。当肿瘤长至70到100 mm3的时候,每隔24小时腹腔注射生理盐水或者含FTY720(5或10mg/kg)的生理盐水,一共注射10天。之后再观察10天肿瘤体积的变化。肿瘤体积计算公式为(长x宽2)x 0.52。再观察10天肿瘤体积变化后将肿瘤剥离出来,通过Western blot检测自噬(LC3)、凋亡(PARP)、坏死(RIP 1, RIP3)、侵袭和迁移(MMP-2, MMP-9)指标的变化。结果：FTY720能显著减少肿瘤的生长速度而对裸鼠的体重无明显改变。FTY720作用后肿瘤组织内LC3-Ⅱ, PARR, RIP1, RIPS的表达显著升高,而MMP-2，MMP-9的表达降低。结论：FTY720可以抑制肿瘤的生长,诱导肿瘤组织的自噬、凋亡和坏死并且抑制侵袭和迁移。总结本课题研究结果从体内体外两方面证实了FTY720可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胶质母细胞瘤自噬、凋亡和坏死并且抑制胶质母细胞瘤侵袭和迁移。因此,FTY720可以为胶质母细胞瘤的治疗提供一个新的思路并且可以和其他抗肿瘤药物联用从而克服肿瘤耐药,起到更好的抗肿瘤效果。