玉米是主要的粮食作物和重要的工业原料。由于世界人口增长和环境恶化,加之世界耕地面积逐渐减少,如何提高玉米的抗逆性和产量已成为玉米育种研究中的一个重要问题。通过对作物抗逆基因的鉴定,将转基因技术与传统育种技术相结合,可以有效提高作物的抗逆性和产量。因此,挖掘抗逆相关基因,研究它们的功能及抗逆机制是作物育种的基础性工作。本研究以玉米15 kDa硒蛋白同源基因ZmSep15-like为研究对象,利用玉米突变体和拟南芥等相关材料,通过NaCl和PEG(甘露醇)模拟自然环境中的盐、旱胁迫,对ZmSep15-like基因的功能和作用机制进行了比较系统的研究,主要结果如下:1 ZmSe15-like基因克隆及分子结构特征数据库信息分析发现玉米中存在一个Sep15同源基因。以野生型W22的cDNA为模板,设计特异性的PCR扩增引物,得到了 2个选择性剪切的ZmSep15-likecDNA序列,分别命名为ZmSep15-like-1/2。结合动物及水稻、小麦等植物Sep15基因序列,分析了ZmSep15-like基因的序列特征、分子进化、功能结构域及三级结构等特点,结果发现Sepl5在所有物种中均十分保守且存在两个相同的保守功能结构域:位于N-端的富含半胱氨酸的UDP葡萄糖:糖蛋白糖基转移酶结合域(UGGT)和位于C-端的参与氧化还原作用的硫氧还蛋白样结构域(TRX-like)。亚细胞定位显示ZmSep15-like主要定位于内质网中。通过qRT-PCR技术对ZmSep15-like基因在不同组织及盐和渗透胁迫下的表达模式进行分析,发现两个选择性剪切的ZmSep15-like的表达并无组织特异性,但在种子和叶中表达相对较高。在盐和渗透胁迫下ZmSep15-/ike的表达水平也呈现出一定的规律,且能够被盐和渗透胁迫所诱导。2 ZmSe15-like基因功能以玉米W22、zmsep15突变体及其杂合体为材料,分别利用20%PEG和200 mM NaCl处理三叶期的玉米幼苗48 h。相对于野生型来说,突变体的叶片干枯萎焉程度更加严重,且在相对水分含量、脯氨酸、叶绿素等生理指标上也较野生型表现出了敏感的表型。进一步用20%PEG和200 mM NaCl对突变体和野生型的杂交F2遗传群体进行处理,发现该基因与表型是连锁关系。通过对未折叠蛋白反应(UPR)bZIP家族marker基因、ER stress marker基因BiP及PDI的表达进行分析,表明ZmSep15-like可能同样参与了植物ER stress的调控;进一步分析发现突变体蛋白羰基含量明显增加,而蛋白巯基含量显著降低,表明该基因的表达缺失导致了植物在胁迫下ER stress的增加。同时在突变体中定位于内质网中的一个与氧化胁迫相关的基因ERO1的表达也明显上调,且突变体中丙二醛含量显著增高,这表明突变体中的氧化胁迫增加。进一步分析发现相比于野生型,突变体在盐和渗透胁迫处理下积累了更多的ROS,且突变体中ROS产生相关基因的表达明显的增加,而ROS清除相关酶的活性发生了显著降低,这表明ZmSep15-like参与了氧化还原平衡的调节。突变体在盐和渗透胁迫处理下,叶片的干枯萎焉更加严重、叶绿素含量更低,这是否与细胞凋亡有关呢?通过台盼蓝染色分析发现在盐和渗透胁迫处理下突变体比野生型细胞死亡程度更加严重、细胞活性更低,且在突变体中凋亡促进因子的表达明显增加,而凋亡抑制因子的表达显著降低,同时离子泄露更加严重,这表明ZmSep15-like的缺失导致了突变体在盐和渗透胁迫处理下细胞凋亡的敏感性增加。将ZmSep15-like-2在拟南芥中过表达,同时进行200 mM甘露醇和100 mM NaCl处理的表型分析,发现拟南芥过表达ZmSep15-like-2能显著增强拟南芥对甘露醇和NaCl的抗性,过表达系在根长和叶片大小上更具有优势,进一步分析发现ZmSep15-like-2过表达能降低拟南芥在甘露醇和NaCl处理下的ER stress、ROS积累及细胞凋亡的敏感性,这进一步说明了ZmSep15-like 参与了相关的生理过程和信号途径。将突变体和野生型玉米在二硫苏糖醇(DTT)和衣霉素下处理48 h,发现两种内质网抑制剂均能导致突变体中ER stress的增大且积累更多的ROS,这表明ER stress可以直接诱导ROS的积累。3 ZmSp15-like基因响应逆境胁迫的机制动物Sep15同源蛋白能够与UGGT互作,共同参与了内质网中N-糖蛋白的重折叠过程。通过分析发现玉米中存在两个UGGT基因,分别是Zm UGGT1和Zm UGGT2,均定位于内质网中。典型的UGGT蛋白具有两个功能结构域:位于N端的糖基结合域和位于C端的Glyco-transf-8(GT8)家族的糖基转移结构域。生物信息学分析表明ZmUGGT1与典型UGGT的C-末端高度相似,具有GT8家族结构域,而ZmUGGT2与N端糖基结合域高度相似。通过酵母双杂、BiFC、Co-IP及遗传实验证实ZmSep15-like-2与ZmUGGT1能够互作结合且UGGT位于ZmSep15-like-2的下游;ZmSep15-like-2的表达能够影响玉米和拟南芥中UGGT的活性。研究表明ZmUGGT1和ZmUGGT2可能通过互作形成二聚体。把ZmUGGT1和ZmUGGT2分别转化酵母及拟南芥atuggt突变体,并把两个拟南芥转化系杂交得到共表达ZmUGGT1和ZmUGGT2的杂交系,然后进行甘露醇和NaCl的表型分析,发现单独转化ZmUGGT2的酵母和拟南芥与野生型酵母和atuggt突变体相比均没有明显的差异,而单独转化ZmUGGT1的酵母和拟南芥均比单独转化ZmUGGT2的酵母和拟南芥表型要好,而共同转化ZmUGGT1和ZmUGGT2的酵母和拟南芥生长表型最好,这说明虽然ZmUGGT1具有糖基转移的能力,ZmUGGT2不具有糖基转移的能力,但是ZmUGGT2可能通过与ZmUGGT1互作形成一个二聚体来增强ZmUGGT1的活性,以使其能更好参与内质网中N-连糖蛋白的重折叠,缓解ER stress。