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急性应激障碍(acute stress disorder,ASD)是指机体在经历应激后数分钟到数小时开始出现的一过性精神障碍,表现为分离、回避、再体验与高唤醒三个特征性症状群,2-3天最明显,一般持续3天到一周,影响机体正常工作和生活。机体在急性应激期表现为中枢神经系统的完整性不变,但神经递质和神经内分泌系统功能发生改变,此时与应激相关的中枢组织如海马、杏仁核、下丘脑和前脑皮层等,发生功能甚至结构上的变化,从而导致一系列行为改变。转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是中枢神经系统内一种与刺激相关的重要核蛋白,应激后CREB自身磷酸化成为P-CREB,处于活化状态,进一步发挥保护神经元、修复和促进神经元再生的功能。CREB在中枢与应激的关系已受到密切关注且研究较为成熟,但目前关于外周组织CREB表达与应激的关系尚不清楚,应激后外周血液中CREB表达量如何变化,CREB与P-CREB表达是否存在与中枢一致的改变,血液中CREB含量变化与应激后行为变化是否存在相关性等都是需要探讨的问题。本研究以不可逃避足底电击方式建立急性应激小鼠模型,以矿场实验、高架十字迷宫实验评价小鼠应激后的焦虑及探索行为,以Morris水迷宫实验评价小鼠学习记忆功能,检测CREB在血清和海马中不同时间的变化特点,探讨行为变化与CREB表达的相关性。目的:(1)分析急性应激后小鼠的行为改变特点;(2)寻找应激后小鼠血清中CORT、CREB、P-CREB表达以及海马CREB、P-CREB表达随时间变化的规律;(3)探讨急性应激后CREB、P-CREB在血清中的表达与行为学变化的相关性。材料与方法:(1)研究对象及分组方法以C57小鼠为实验研究对象,采用组间随机对照设计方法,将行为学实验评分相近的108只小鼠随机分为应激组和对照组,每组54只;再将每组按电击后0h、6h、12h、24h、26h、48h、72h、7d和21d九个时相点随机分成九小组,按小组顺序先后被放入电击箱,应激组小鼠接受足底电击,对照组只进入电击箱,但不接受任何处理。行为学实验分为旷场实验、高架十字迷宫实验和水迷宫实验(电击后26h),按时间顺序在每个时相点从两组各取相应的6只小鼠进行行为学评价程序;行为学测试结束后,立即取静脉血检测血清CREB、P-CREB、CORT浓度,取血后断头取脑分离出海马组织,检测齿状回中CREB、P-CREB表达。(2)建模方式及行为学评价方法急性应激采用不可避免足底电击方式,将小鼠置于长×宽×高(18cm×13cm×22cm)的电击箱中,给予10次足底电击(电流1.5mA,持续6s,间隔时间15s)。记录旷场实验中,10min内小鼠中央区域活动路程、中央区域活动时间、站立次数,用以评价小鼠自发行为、焦虑和探索行为;记录高架十字迷宫实验中,5min内小鼠进入开臂的次数(OE)、待在闭臂的时间(CT),用以评价小鼠焦虑及探索行为;记录小鼠Morris水迷宫实验中,前四天的逃避潜伏期以评价小鼠的空间学习能力,第五天穿越平台次数及目标象限游程比例以评价小鼠空间记忆能力。(3)血清和海马组织CORT、CREB及P-CREB表达的检测方法分别在每组行为测试完成后立即取血,离心取血清,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测CORT、CREB、P-CREB含量;取血后立即断头取海马组织,采用免疫组织化学(IHC)方法检测小鼠海马齿状回CREB和P-CREB表达。(4)统计学方法用SPSS18.0软件包对实验数据进行统计学处理,采用非配对t检验进行电击组和对照组的比较,两组不同时间各指标间总体比较采用单因素方差分析,水迷宫定位航行训练中两组逃避潜伏期采用重复测量方差分析,各观察指标间相关性采用pearson相关分析;以P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)体重变化电击前两组小鼠体重间差异无统计学意义(P>0.05);对照组小鼠体重在12h开始增长,48h及之后的体重与电击前比较差异有统计学意义(P<0.01);应激组小鼠体重在电击后72h开始增长,7d及以后的体重与电击前比较差异有统计学意义(P<0.01)。(2)电击箱内情况应激组和对照组小鼠比较,电击箱内跳跃次数、僵直时间和不动时间在每个时间点差异均有统计学意义(P<0.01);两组小鼠各指标在不同时间点间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)行为学变化与对照组比较,急性应激组小鼠的站立次数在6h、12h、72h显著减少(P<0.05),中央区域活动路程在电击后0h、6h、12h、72h显著减少(P<0.05),中央区域活动时间在电击后6h、12h、24h、72h、7d、21d显著降低(P<0.05),进入开臂次数在6h、12h、72h显著减少(P<0.05),闭臂停留时间在6h、12h、48h、72h、7d显著增加(P<0.05)。两组小鼠逃避潜伏期都随时间降低,应激组第3天与第1天差异显著(P<0.01),第4天与第1、2、3天差异显著(P<0.01);对照组第2、3、4天与第1天差异显著(P<0.05);与对照组比较,急性应激组小鼠在第1、2天逃避潜伏期显著延长(P<0.01),第4天逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),第5天穿越平台次数显著增多(P<0.01),但两组小鼠在目标象限的游程比例无显著性差异(P=0.114)。(4)血清CORT,CREB及P-CREB含量与对照组比较,急性应激组小鼠血清CORT浓度在0h、6h、12h、48h、72h显著升高(P<0.01),血清CREB浓度在0h、6h、12h(P<0.01)和72h(P<0.05)显著降低,血清P-CREB浓度在电击后0h、6h(P<0.01)和72h(P<0.05)显著升高,电击后24h、21d降低但差异无统计学意义(P>0.05)。(5)海马CREB,P-CREB表达应激组小鼠海马齿状回CREB的表达在电击后0h、6h显著少于电击后12h、24h(P<0.01);与对照组比较,急性应激组CREB阳性细胞数在电击后0h、6h、7d和21d显著减少(P<0.05)。应激组小鼠海马齿状回P-CREB的表达在电击后0h、6h、12h、48h、72h显著强于电击后24h、7d、21d(P<0.05),电击后24h明显强于电击后7d、21d(P<0.05);与对照组比较,急性应激组齿状回P-CREB的表达在电击后0h、6h、72h显著增强(P<0.05),电击后7d、21d显著减弱(P<0.05)。水迷宫实验后,急性应激组小鼠齿状回CREB表达与对照组比较差异无统计学意义,P-CREB表达较对照组显著增加(P<0.05)。(6)CREB,CORT,P-CREB与行为学指标间的相关性应激组和对照组小鼠旷场中站立次数、中央区域活动路程、中央区域活动时间均呈显著正相关(P<0.05),且应激组OE与CT呈显著负相关(P<0.01);应激组各旷场指标与OE均呈显著正相关(P<0.01),站立次数、中央区域活动时间与CT呈显著负相关(P<0.01),对照组中央区域活动路程与OE呈显著正相关(P<0.05)。应激后小鼠血清CREB与P-CREB、CORT呈显著负相关(P<0.01),P-CREB与CORT呈显著正相关(P<0.01),血清CREB浓度与旷场各指标、OE均呈显著正相关(P<0.05),血清P-CREB浓度与中央区域活动路程、OE呈显著负相关(P<0.05),对照组各指标间相关性均无统计学意义(P>0.05)。研究结论:(1)急性应激可导致小鼠自发活动及探索样行为减少、焦虑恐惧增加,但探索行为恢复较快,焦虑行为恢复缓慢。(2)急性应激对小鼠行为改变的影响在应激后12h内明显,24h基本恢复,但应激后48h和72h小鼠行为再次出现显著改变,该时间段可能处于应激后高唤醒敏感时期。(3)急性应激后小鼠学习能力逐渐增强,在应激后期表现明显,且急性应激可促进小鼠记忆功能增强及对空间定位的准确性。(4)急性应激后小鼠血清中存在CREB、P-CREB的表达,在应激后早期血清浓度变化最明显,且血清改变与海马CREB表达存在一定平行关系;急性应激可降低血清及海马CREB表达但可以增强P-CREB表达。(5)急性应激后小鼠行为改变与血清CREB、P-CREB含量存在一定相关性。研究结果说明,急性应激致小鼠行为改变与CREB的表达变化具有一定时空相关性,外周血液中CREB、P-CREB的表达随时间逐渐恢复,但急性应激后48h至72h可能成为关键的检测时间点。