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免疫检查点是T细胞活化调控的重要机制,其持续表达是耗竭T细胞的重要标志。基于免疫检查点分子阻断（Immune checkpoint blockade,ICB）的治疗可以有效恢复耗竭T细胞功能,促进肿瘤清除并延缓肿瘤进展。目前针对PD-1（Programmed cell death protein-1）的阻断抗体已经在临床取得了良好疗效。然而,肿瘤患者对PD-1抗体阻断治疗抵抗的现象极大的限制了其临床应用。Tim-3（T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3）作为一种免疫检查点分子,不仅高表达于慢性病毒感染和肿瘤个体T细胞,介导T细胞耗竭,而且异位表达于肿瘤细胞,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。近期有多项研究表明,联合阻断Tim-3和PD-1显著增强T细胞功能,抑制肿瘤生长。基于Tim-3在T细胞耗竭和肿瘤免疫逃逸中的关键调控作用,Tim-3成为目前研究最多的免疫治疗靶点之一。已有研究证实,Tim-3在小鼠及人中通过不同方式产生天然的可溶性形式,即sTim-3（soluble Tim-3）。临床研究显示,血清sTim-3水平与肿瘤、病毒感染等多种疾病进展相关。然而,sTim-3是否参与T细胞调控,是否与肿瘤患者PD-1阻断治疗抵抗相关,目前尚未有报道。针对上述关键问题,本研究开展临床研究及体内外实验,主要研究结果如下:一、肿瘤患者血清sTim-3显著升高,并与PD-1抗体治疗抵抗相关为探究sTim-3在肿瘤进展中的作用,我们收集了 65例非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者以及23例健康人的血清。酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）结果显示,NSCLC 患者血清 sTim-3 水平显著升高,恶性程度更高的肺癌患者血清sTim-3更高,且高水平的sTim-3与NSCLC患者的不良预后显著相关。更重要的是,在接受PD-1阻断治疗的患者中,PD-1阻断治疗无应答的患者血清中sTim-3水平显著高于PD-1阻断治疗应答患者。此外,胃癌、结直肠癌、肝癌、胆管癌等多种肿瘤患者血清中sTim-3水平均较健康人显著升高。二、sTim-3 过表达促进荷瘤小鼠肿瘤进展及PD-1抗体治疗抵抗已有研究报道人Tim-3通过在近细胞膜端切割膜Tim-3产生,因此我们使用人Tim-3的胞外段作为sTim-3来研究其在肿瘤进展中的作用。体外增殖实验结果显示sTim-3并不直接影响肿瘤细胞的增殖。体内实验发现,以sTim-3稳定过表达的B16-M05细胞进行皮下成瘤,sTim-3过表达黑色素瘤体内生长显著加快,小鼠生存期缩短。进一步在Tim-3敲除（Tim-3-/-）小鼠重复上述实验,证明sTim-3对肿瘤生长的促进作用不依赖于膜型Tim-3。为证明sTim-3的促肿瘤表型是否具有肿瘤类型特异性,通过水动力注射（Hydrodynamic injection,HDI）法建立小鼠原发性肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）模型,同时注射表达人sTim-3的载体（PT3/sTim-3）进行干预,注射空载体（PT3/GFP）组为对照。与对照组相比较,sTim-3组的小鼠肿瘤进展更快,生存期更短。为明确sTim-3对PD-1阻断治疗的影响,在小鼠ICC模型中进行PD-1抗体治疗,并同时联合过表达sTim-3。结果显示,PD-1抗体治疗有效降低小鼠肝脏中的荧光素酶表达,延长小鼠生存期。然而,当在小鼠体内过表达sTim-3后,PD-1阻断抗体抑制肿瘤生长和延长小鼠生存期的作用消失,即sTim-3促进肿瘤PD-1抗体治疗抵抗。三、sTim-3抑制T细胞功能及其PD-1抗体响应性PD-1抗体治疗的主要目的是逆转T细胞耗竭。为探究sTim-3是否调节T细胞功能,首先对经过sTim-3蛋白处理的OT-I CD8+T细胞进行转录组测序（RNA-seq）。基因集富集分析结果（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）显示,与sTim-3处理的细胞相比,促进T细胞活化和增殖相关的特征基因在对照组细胞中显著富集。进一步实验表明,sTim-3显著抑制TCR信号通路活化,抑制T细胞效应细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌,并抑制CTLs的杀伤功能。为在体内验证sTim-3的免疫调节作用,分离前述B16-M05皮下成瘤模型小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes,TILs）进行免疫表型分析。结果显示,与对照组相比,sTim-3过表达组的小鼠肿瘤浸润T细胞的数目显著减少、功能下调、抑制性受体PD-1和LAG-3（Lymphocyte activation gene-3）水平显著升高,肿瘤微环境中免疫抑制性细胞比例显著增加。GSEA富集分析结果显示,sTim-3处理后的T细胞中显著富集PD-1抗体治疗不响应的特征基因集。与此一致,sTim-3蛋白处理后的OT-I CD8+T细胞不再对PD-1抗体产生响应。进一步的ELISA结果表明,sTim-3蛋白显著抑制HCC患者TIL分泌IFN-γ和 TNF-α 的能力,并未影响 PBMCs（Peripheral Blood Mononuclear Cells）功能。更重要的是,虽然PD-1抗体明显促进TIL分泌IFN-γ的能力,但sTim-3处理后抑制了 PD-1抗体的上述作用。上述结果提示,sTim-3促进T细胞PD-1治疗抵抗,且sTim-3调控T细胞功能与肿瘤微环境相关。四、sTim-3通过CEACAM-1抑制T细胞功能、促进PD-1抗体治疗抵抗CEACAM-1作为已知的Tim-3配体,主要在T细胞膜表面表达并且抑制T细胞功能。我们在前述sTim-3发挥抑制作用的OT-ICD8+T和人TILs检测到较高的CEACAM-1表达,在sTim-3不发挥作用的人PBMCs上并未检测到CEACAM-1表达。因此,sTim-3调控T细胞功能及PD-1抗体响应性可能与CEACAM-1相关。为明确上述假说,对不表达CEACAM-1的人T细胞系Jurkat细胞进行CEACAM-1过表达,结果表明sTim-3抑制T细胞功能依赖于CEACAM-1;对表达Ceacam-1的OT-I CD8+T细胞上转导Ceacam 1的shRNA,发现沉默Ceacam-1表达后,sTim-3过表达不再影响OT-I CD8+T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌水平。进一步利用PD-1中和抗体和sTim-3蛋白处理上述干扰Ceacam-1的OT-I CD8+T细胞,结果显示,干扰Ceacam-1表达后,sTim-3不再影响PD-1抗体介导的T细胞功能调控。五、抑制sTim-3产生逆转人肝癌浸润T细胞PD-1抗体抵抗有研究报道人sTim-3是由金属切割酶ADAM10和ADAM17通过切割膜型Tim-3产生。使用ADAM10和ADAM17抑制剂体外处理HCC患者PBMCs,结果表明两者均可以完全阻断sTim-3产生。分离PD-1治疗抵抗的HCC患者肿瘤浸润淋巴细胞,使用PD-1阻断抗体和ADAM10抑制剂进行体外处理。结果显示ADAM10抑制剂明显上调上述PD-1抗体响应差的HCC患者T细胞的功能。更重要的是,PD-1抗体与ADAM10抑制剂的联用可以进一步加强IFN-γ的产生。研究结论与意义:本研究首次证实sTim-3与肿瘤患者PD-1治疗抵抗密切相关;sTim-3通过与其受体CEACAM-1结合抑制T细胞功能、介导PD-1治疗抵抗;靶向sTim-3产生的抑制剂可以增强肝癌患者肿瘤浸润T细胞对PD-1抗体治疗的响应性。我们的研究揭示了 sTim-3在肿瘤免疫逃逸和PD-1阻断治疗抵抗中的关键作用,为揭示肿瘤发生机制和免疫检查点治疗提供了新的思路。