论文部分内容阅读
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界四大粮食作物之一,在保障世界粮食安全中起着重要作用。马铃薯生产中最严重的病害是由卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病。系统解析马铃薯晚疫病抗性机制,对于探索和寻找晚疫病防治策略,指导抗病育种和晚疫病科学防治具有重要意义。大量研究证明翻译后修饰在植物PTI和ETI免疫应答中起重要的作用。通过泛素化调节蛋白的稳定性是重要的转录后水平的调控途径之一。许多RING类型的E3s参与植物免疫信号的传递和调节。ATL家族是带有RING类型的泛素连接酶蛋白,包含跨膜结构域、GLD结构域和RING结构域,ATL家族的蛋白广泛参与调节植物的生长发育、抗病抗逆反应。前期研究表明马铃薯ATL家族基因St RFP1参与晚疫病抗性,本研究克隆了茄科抗病研究模式植物本氏烟中St RFP1的同源基因Nb ATL60,在马铃薯和本氏烟中进一步系统深入研究了St RFP1在免疫应答调控中的作用。主要研究结果如下:1.通过检测晚疫病菌培养液(CF,含有潜在晚疫病菌PAMPs)和PAMPs flg22处理后马铃薯和本氏烟中St RFP1和Nb ATL60的基因表达,发现这两个基因均能够强烈响应CF和flg22的诱导表达,表明St RFP1和Nb ATL60参与茄科植物的PTI应答。2.St RFP1和Nb ATL60具有预测的跨膜结构域,激光共聚焦显微观察表明St RFP1-GFP和Nb ATL60-GFP蛋白主要分布在细胞膜上,同时在内质网和胞内观察到很强的点状荧光信号,预示这两个蛋白在膜和胞内存在动态转运。另外,显微观察发现,CF和flg22处理不会影响瞬时表达St RFP1和Nb ATL60的亚细胞定位。3.体外泛素活性检测研究表明,去除跨膜域的原核表达蛋白St RFP137-262和Nb ATL6034-256具有E3泛素连接活性。突变RING finger结构域的St RFP137-262(H124A)和Nb ATL6034-256(H127A)丧失泛素活性,证明RING finger结构域是E3泛素连接活性的关键结构域。4.用强毒力晚疫病菌小种进一步鉴定马铃薯St RFP1超量和干涉转基因株系晚疫病抗性,结果表明超量株系抗性提高,干涉株系抗性下降。同时在本氏烟上瞬时表达St RFP1-MYC和Nb ATL60-MYC后显著提高晚疫病抗性,但是瞬时表达丧失泛素活性的RING finger突变体St RFP1-mut-MYC和Nb ATL60-mut-MYC则不能抑制晚疫病菌扩展,表明E3泛素连接酶活性是St RFP1和Nb ATL60实现免疫调控功能所必需的。5.利用病毒介导的基因沉默(VIGS)方法在本氏烟中沉默Nb ATL60。发现沉默株系表现明显的矮化表型,预示Nb ATL60参与调节植株生长发育。抗性评价表明VIGS Nb ATL60本氏烟晚疫病抗性显著下降。表明St RFP1和Nb ATL60在调控晚疫病抗性免疫应答中具有相同的功能。已有研究显示,部分ATLs参与调控细胞死亡,本研究发现沉默Nb ATL60不能抑制晚疫病菌PAMP INF1以及R基因及相应无毒基因对Rx/Cp、R2/Avr2、R3a/Avr3a和Pto/Avr Pto诱发的细胞死亡。6.在St RFP1马铃薯转基因株系和VIGS沉默Nb ATL60本氏烟中检测了4个PTI途径marker基因对CF和flg22的响应。结果发现,超量表达转基因株系中WRKY7、WRKY8和ACRE31表达极显著增加,而在干涉株系中4个PTI marker基因均下调表达。在VIGS沉默Nb ATL60本氏烟中,Nb WRKY7,Nb WRKY7,Nb ACRE31和Nb Pti5均表现下调趋势。因此,St RFP1和Nb ATL60均参与调控PTI途径抗病防御基因的表达。7.为了进一步探究St RFP1在植物免疫中如何与其靶标结合发挥功能,本研从膜系统酵母文库筛选出71个阳性克隆,通过酵母点对点验证,发现3个强互作蛋白Stβ-GLU08、St HMA和St LD以及两个弱互作蛋白St ACY和St14-3-3。黄色荧光互补(Bi FC)进一步验证St ACY和St14-3-3均与St RFP1互作。在本氏烟中瞬时表达St ACY-MYC和St14-3-3-MYC能够阻止晚疫病菌扩展,表明St ACY和St14-3-3正调控晚疫病抗性,预示E3泛素连接酶St RFP1增强晚疫病抗性的调控不是通过降解St ACY和St14-3-3来实现,St RFP1与互作蛋白间可能存在其它靶标共同参与抗性调控。