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蕨类植物具有丰富黄酮类化合物,是蕨类中重要的药用成分;蕨类黄酮的代谢途径仍不清楚,阐明其代谢途径对解释蕨类植物黄酮代谢的机制,调控黄酮的表达具有重要意义;肾蕨(Nephrolepis auriculata(Eaton)O.Ktze)是传统的中药材,含有丰富的黄酮类化合物,具有治疗感冒发烧、咳嗽、痢疾及抗癌等功能。肾蕨具有容易采集、培养的特点,本文以肾蕨为材料,对其黄酮含量进行了测定,克隆到其查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,并对该基因做了原核表达,对其进行原核表达条件进行了优化及基因功能的分析。本研究对阐明蕨类植物黄酮代谢及调控的机制具有一定的科学意义。本研究获得的主要结果如下:1.分别对肾蕨的根茎、叶轴、羽片总黄酮进行了测定,结果表明肾蕨含有丰富的黄酮,叶轴和羽片中的黄酮含量均为2%左右,根茎中的黄酮含量显著高于地上部分,达到6%。由此肾蕨可作为试验材料进行黄酮代谢途径分子生物学研究。2.对肾蕨的查尔酮合成酶进行基因克隆与功能分析:以肾蕨叶中提取的RNA为模板,通过PCR技术获得肾蕨的查尔酮合成酶基因ORF序列和基因组序列。生物信息学分析表明,该基因ORF区为1209 bp,编码402个氨基酸,蛋白酶分子量为44 KD。含有一个内含子并且遵循gt/ag剪切规则。BLAST序列比对发现肾CHS基因(Na CHS)与其它物种的该基因同源,通过构建进化树进行同源性分析,表明Na CHS基因与渐尖毛蕨、槐叶萍、水蕨等蕨类的CHS基因亲缘关系更近。分析表明不同物种CHS基因在序列上有差异,这种差异对揭示物种间亲缘关系有重要意义,或者对基因功能有一定影响。将CHS目的片段与Pet32a载体连接构建原核表达载体转化到大肠杆菌BL21中,使用IPTG诱导蛋白表达,进行SDS-PAGE分析,肾蕨CHS基因在大肠杆菌中得到表达,形成了一个大小为63 KD的蛋白,与预期结果相符合。体外酶活实验验证了原核表达的肾蕨CHS蛋白具有活性,能催化底物生成柚皮素,进一步说明表达的蛋白为Na CHS。3.原核表达影响因素。(1)以IPTG为诱导剂诱导蛋白表达,对表达的蛋白进行定量检测,蛋白表达量呈增长趋势,且在表达1 h时蛋白表达变化量最明显,4 h时累计蛋白表达量最多;(2)设置IPTG浓度梯度,在诱导表达4h时取样检测菌体浓度及进行蛋白定量检测,随着IPTG浓度增大,菌体生长有受到抑制趋势,加入IPTG浓度至0.1-0.2 mmol/L蛋白表达量较大;(3)设置温度梯度,分别为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃及40℃,随温度增高表达蛋白总量有增大趋势,其他实验证实在37℃时菌体生长最快,且本实验证实在37℃表达的CHS中依然有一部分具有可溶性,最适表达温度为37℃;(4)设置菌体诱导表达前浓度梯度,浓度分别为0.224,0.385,0.621,1.120。在菌体浓度为0.621和1.120表达量较高。综上所述,黄酮含量测定表明肾蕨含有丰富的黄酮类化合物,分子生物学研究表明克隆到的Na CHS基因表达的CHS是肾蕨黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶;功能分析表明Na CHS基因原核表达产物具有较高的酶活性;经实验分析CHS最佳诱导条件为:菌体生长至OD600=0.6左右,以0.1 mmol/L IPTG在37℃诱导1 h为最佳表达条件。本研究为蕨类黄酮类化合物的生物合成途径的研究奠定了基础,对阐明蕨类植物中黄酮类化合物生物合成的调控机制也具有一定意义。