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血吸虫病是人畜共患寄生虫病。血吸虫感染的实验诊断在血吸虫病防治中发挥重要作用,目前血吸虫虫卵依然是主要的血吸虫病诊断抗原,对血吸虫虫卵的提取、虫卵可溶性抗原(SEA)的认识依然不足。本课题目的是建立一种快速提取纯净虫卵的方法;检测用该法提取虫卵制备SEA作为血吸虫病检测抗原的可行性;然后采用免疫亲和层析的方法收集与血吸虫病IgG发生特异性结合的SEA组分并进行鉴定和分析;最后从鉴定的抗原组分中选取一种抗原进行基因的克隆表达,检测其作为诊断抗原的价值。用不同浓度的NaOH、在不同温度、用不同时间消化含有虫卵的肝脏匀浆液,以确定虫卵提取最佳条件;用方阵实验确定以此法提取的SEA最佳抗原包被浓度并采用ELISA法检测现场获得的75份血吸虫阳性、60份血吸虫阴性水牛血清,以评价抗原的检测效果;最终用该SEA组分试制了日本血吸虫血清检测的间接血凝试剂。结果表明NaOH消蚀法提取组织中虫卵的最佳条件为:NaOH浓度为5%~10%,反应温度为45℃,反应时间为5-10min;该法制备的虫卵纯净度高,得率为常规法的3倍以上;NaOH消蚀法提取抗原的检测灵敏度比过筛提取虫卵所得抗原显著性提高(p<0.05);用消蚀法提取虫卵抗原检测水牛血清其灵敏性为93%,过筛法为88%,特异性为100%,过筛法为97%(P>0.05)。所试制的间接血凝试剂对于检测兔、鼠血清具有较好的效果。为进一步从SEA获得具有诊断价值的主要抗原信息,从血吸虫病阳性鼠血清纯化得到IgG,并将其固化到树脂上;通过免疫亲和层析的方法收集与IgG发生特异性结合的SEA抗原组分并进行质谱鉴定、糖蛋白和生物信息学分析。结果显示:阳性BALB/c鼠血清中纯化的IgG通过免疫亲和层析收集SEA的组分保持了抗原性;质谱共鉴定到76个蛋白群的262个蛋白质;主要参与血吸虫的代谢过程、生物调节、应激反应等;这些蛋白具有结合及催化活性、电子载体活性、酶调节活性等相关功能;Dot-blot/SDS-PAGE结合糖蛋白染色显示,SEA层析组分具有糖链成分且为各种糖蛋白的组合,分子量分布范围从37-170kd;N-端糖基化预测显示抗原组分中有57个蛋白群中的蛋白具有N-端糖基化位点;这些可能的糖蛋白主要参与信号传导、免疫系统过程、应激反应、移动等生物过程。根据虫卵可溶性抗原鉴定信息,选取SjP40蛋白作为研究对象;利用PCR获得了基因的全长表达片段,构建了该基因的原核表达质粒pET-28a(+)-SjP40并获得了重组表达蛋白,rSj P40主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blot显示rSj P40有较好的免疫原性;收集感染血吸虫不同阶段的的BALB/c鼠血清检测显示rSjP40具有早期诊断效果。