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新型广谱β-内酰胺类抗生素被广泛应用于临床和畜牧养殖业,受其高选择性压力作用,细菌产生出一类新的β-内酰胺酶（β-lactamase,bla）,其水解的底物比广谱酶更为广泛,称之为超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum-beta lactamase,ESBL）,它能快速水解β-内酰胺类抗生素,使得细菌对此类抗生素具有耐药性。ESBL多为肠杆科细菌产生,包括TEM、SHV、CTX-M和OXA等多个类型,其中CTX-M型是我国最为流行的基因型。我国水体中存在产ESBL菌株,此类菌株耐药基因可在致病菌和条件致病菌之间传播,如果伤口被水中产ESBL菌株感染,治疗将非常困难,这对从事渡江、渡海作战部队或其他涉水作业人群构成了新的健康危险。虽然人们对产ESBL菌株耐药问题关注已久,但关于水环境中产ESBL细菌扩散及危害研究得很少。我室对长江水系耐药菌污染问题进行了长期研究,发现江水中产ESBL耐热大肠菌群污染严重,质粒携带率高,呈多耐药特点。bla基因主要由质粒介导,其中接合性质粒占多数,在bla基因转移中起主导作用,非接合性质粒所占比例较小,仅在特定条件下才能实现bla基因的转移,无论接合性质粒还是非接合性质粒,都在bla基因水平转移中发挥作用。我室陈浩证实产ESBL菌株可通过饮水途径将bla基因水平传递给小鼠肠道内定殖的大肠埃希菌。目前尚无水中产ESBL菌株在伤口水平转移耐药基因及定殖方面的报道。因此,有必要对水环境中产ESBL菌株bla基因水平转移及其危害进行深入研究和探索。基于考虑质粒在bla基因传播中所起的重要作用及非产ESBL菌株获得bla基因后的潜在危害,本课题以产ESBL大肠埃希菌为切入点进行研究,分四个部分,第一部分研究了携带可接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌bla CTX-M基因水平转移的影响因素;第二部分研究了携带非接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌捕获氨基糖苷类修饰酶编码基因（aminoglycoside modifying enzyme, AME）与bla CTX-M基因水平转移;第三部分观察了烧伤伤口被产ESBL与非产ESBL大肠埃希菌混合感染时的bla CTX-M基因水平转移;第四部分研究了非产ESBL大肠埃希菌获得bla CTX-M基因前后在烧伤伤口定殖转移能力。实验方法1.水样采集与菌株的分离鉴定从长江和嘉陵江采集水样,低温保存,并于4 h内将水样送至实验室,用滤膜法检测菌落总数、大肠菌群和耐热大肠菌群;水样经稀释和过滤后,用含头孢噻肟（CTX）的M-FC培养基筛选菌株,挑取蓝色菌落用梅里埃自动生化分析仪鉴别菌种;用标准纸片扩散法测定菌株耐药谱;用双纸片法进行产ESBL确证。2.温度与pH值对产ESBL菌株体外接合影响的观察将长江水中2株携带接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌（编号E. coli 425和E. coli 452）与非产ESBL但对利福平高度耐药的E. coli NK5449混合接种于LB液体培养基中,观察在温度和pH值两个因素对产ESBL大肠埃希菌bla CTX-M基因转移效率的影响。3.产ESBL大肠埃希菌对AME基因的捕获与bla CTX-M基因转移将携带非接合性质粒的2株产ESBL菌株（编号E. coli 293和E. coli 310,产ESBL,对庆大霉素敏感）与受体菌（编号E. coli 295,非产ESBL,携带接合性质粒,对庆大霉素耐药）进行接合,形成转移接合子,再次将该转移接合子与E. coli NK5449进行接合,观察AME基因捕获与bla CTX-M基因水平转移;用PCR方法检测分析供、受体菌与转移接合子受试菌株bla基因型、AME基因及整合子携带情况,并用随机扩增多态性分析（random amplified polymorphic DNA,RAPD）技术判断相关菌株同源性。4.烧伤伤口内细菌耐药基因水平转移以及与液体中耐药基因水平转移比较将10只20～22g雄性BALB/c小鼠均构建为深Ⅱ度局部烧伤模型（烧伤位于臀背部,烧伤面积为体表面积的3%）随机分为混合感染组（7只）和空白对照组（3只）。向混合感染组小鼠烧伤区皮下混合注入菌液,产ESBL的E. coli 452与非产ESBL的E. coli NK5449各0.1 ml,菌液浓度为1.5×108 CFU/ml;向空白对照组小鼠烧伤区皮下注射0.2 ml灭菌PBS。感染后2 d,取烧伤区肌组织,称量后制成匀浆,经系列稀释后用含头孢噻肟（CTX,64μg/ml）与利福平（RIF,160μg/ml）的M-FC平板筛选转移接合子,用含利福平的（RIF,160μg/ml）M-FC培养基筛选受体菌,计算接合频率,并检测转移接合子同源性。将E. coli 452与E. coli NK5449在液体培养基中以37℃混合培养6 h、18 h和48 h的接合频率作对比。5.非产ESBL大肠埃希菌获得bla CTX-M基因前后在烧伤伤口定殖能力比较将21只雄性BALB/c均构建为深Ⅱ度局部烧伤模型并随机分为3组,分别为:对照组（3只）;E. coli C452（E. coli 452与E. coli NK5449形成的转移接合子）感染组（9只）;E. coli NK5449感染组（9只）。分别向感染组小鼠烧伤部位皮下注射受试菌悬液0.2 ml,空白组小鼠以PBS 0.2 ml行皮下注射。感染后1 d、4 d和7 d,每次在各组随机取1/3数量小鼠脱颈处死,无菌操作,取烧伤区皮下的肌组织、空肠上段、肺和肝脏各部分,称重后制成匀浆,经系列稀释后用含头孢噻肟和利福平的M-FC培养基筛选E. coli C452菌株,用含利福平的M-FC培养基筛选E. coli NK5449菌株,并用SPSS 18.0分析软件对各组的肌肉组织、脏器内生长的菌落数进行统计分析。实验结果1.水样检测结果长江水样细菌污染程度明显低于其支流嘉陵江,嘉陵江水样菌落总数、大肠菌群和耐热大肠菌等指标分别为长江水样的11倍、144倍和5倍。实验所用供体菌bla基因型均为CTX-M型,表现为多耐药。2.温度与pH值对菌株接合的影响E. coli 425与E. coli NK5449发生接合的频率随着温度的降低而升高,从35℃到15℃,在pH6.1、pH7.1和pH8.1时分别升高了16.6倍、33.8倍和6.4倍;在35℃和25℃条件下,当pH值为8.1时发生接合的频率要比pH值为6.1时高,但在15℃时有所变化,pH值为6.1时的接合频率要比pH值为8.1时高。相同温度时,pH7.1最适合于接合的发生。产ESBL的E. coli 452与非产ESBL的E. coli NK5449接合的频率随温度显著下降,从35℃到15℃,当pH值为6.1、7.1和8.1时,其接合频率分别降低了620倍、3220倍和15999倍。在相同温度时,pH7.1最适合接合的发生。在35℃和25℃两个温度下,当pH值为8.1时,2株产ESBL大肠埃希菌与受体菌的接合频率均比pH值为6.1时高,而在15℃时有所变化,在pH为6.1时的接合频率高于pH 8.1时的接合频率。3.产ESBL E. coli捕获AME基因与水平转移bla CTX-M基因菌株携带非接合性质粒,可作为受体菌与携带AME基因的非产ESBL供体菌接合,接合频率分别为1.6×10-6和7.2×10-6。借助外来可移动基因元件,其本身又可转变为供体菌,将bla CTX-M基因向其他受体菌水平转移,接合频率分别为3.7×10-6和7.4×10-6。经过对菌株携带的Ⅰ类整合子可变区测序并用Blastn比对,Ⅰ类整合子可变区不含bla CTX-M基因。E. coli 293+295+NK5449、E. coli 310+295+NK5449的质粒与E. coli 295+NK5449的质粒一致,而与E. coli 293和E. coli 310所携带的质粒有明显差异。4.烧伤伤口内细菌bla CTX-M基因水平转移产ESBL E. coli 452与非产ESBL E. coli NK5449混合感染伤口2 d后,在7只小鼠烧伤区肌组织内均筛选出了转移接合子,经检测与E. coli NK5449同源,双纸片法确证为产ESBL菌株,bla基因型为CTX-M,接合的频率为（3.0±0.8）×10-1,最低为2.0×10-1,最高达到4.3×10-1。对照组未培养出菌落。5.非产ESBL大肠埃希菌获得bla CTX-M基因前后在烧伤伤口定殖能力比较E. coli NK5449和E. coli C452两个感染组,在感染后1 d,肝脏和空肠上段组织培养全部为阳性,其中以空肠上段定殖感染菌的数量最多,分别达到2.6×105 CFU/g组织和2.7×105 CFU/g组织。在感染后4 d,肝脏和空肠上段组织菌落培养均为阴性。两组感染菌对烧伤小鼠模型伤口的定殖能力和向其他脏器转移的能力没有统计学差异。感染4 d及7 d,以上2组小鼠脏器内均无感染菌的检出。肺脏则始终无感染菌的检出。空白对照组脏器无菌落生长。结论水的温度和pH值对产ESBL大肠埃希菌bla CTX-M基因转移中有重要影响,在pH值方面,接近中性的环境最适于接合的发生。水温对不同菌株其影响效果截然相反,某些产ESBL大肠埃希菌的接合频率在温度升高时,接合频率上升,另一些产ESBL大肠埃希菌接合频率却随着温度降低反而升高。虽然接合频率在自然情况下会有所降低,但长江水质pH值为7.1～8.3,水温11～26℃,仍适合于bla基因水平转移的发生。与携带接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌相比,携有非接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌缺失bla CTX-M基因转移能力是暂时的,当有外来接合质粒、整合子或其他可移动基因元件协助时,该类菌株可以实现对其他耐药基因的捕获与bla基因的转移,携带非接合质粒的产ESBL大肠埃希菌,可以通过接合方式捕获其他耐药基因,如AME基因,并将bla基因转移到外来可接合性质粒上,实现水平转移,由于这个过程无法用接合性质粒诱动、Ⅰ类整合子主动捕获以及现有转座子转运予以解释,推测可能存在其他转移方式。通过构建小鼠烧伤感染模型,观察到烧伤伤口混合感染时菌株间可以实现bla CTX-M基因水平转移,其接合频率与体外接合6 h的接合频率相当,但低于体外接合48 h时的接合频率,这对不同细菌混合感染也有参考意义;在本实验条件下,非产ESBL大肠埃希菌获得水源性产ESBL菌株bla CTX-M基因前后,在烧伤伤口定殖与转移方面没有统计学差异,说明受体菌在仅获得bla CTX-M基因时,除耐药谱扩大外,其定殖和转移能力不会发生明显变化。本研究的创新点1.实验发现,某些产ESBL大肠埃希菌在较低的环境温度下,其接合频率反而升高,这在之前的文献中没有报道过,虽然机制尚不清楚,但足以说明bla基因转移的广泛性与复杂性。2.在携有非接合性质粒的产ESBL大肠埃希菌接合实验中,观察到了其对AME基因捕获与bla CTX-M基因转移,转移机制不同于接合性质粒的诱动,也排除了Ⅰ类整合子、常见转座子和插入序列作用,因此推断可能存在其他转移方式。3.在烧伤模型伤口内观察到了bla CTX-M基因向受体菌水平转移,这未见在文献中报道,其意义在于,被多细菌感染的伤口在处理不当或延迟的情况下,可能造成bla CTX-M基因迅速向其他条件致病菌或致病菌转移,治疗难度随之增加。4.对受体菌获得bla CTX-M基因前后在烧伤模型伤口定殖与转移能力比较中,虽然未见统计学差异,但观察到感染菌向脏器转移,且以肠道组织内浓度最高。在机体受到严重感染或创伤时,本实验发现的烧伤伤口细菌迁移现象可能与肠道菌迁移现象同时存在,这两种迁移途径在临床治疗与预防中应同时受到重视。实验中存在的不足1.本实验的研究对象仅涉及到了长江和嘉陵江水中的产ESBL大肠埃希菌,而江水中还存在肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌等产ESBL菌株,它们均可携带耐药质粒,因此需扩大研究范围。2.除pH值和温度两个重要因素外,还应考虑到水体β-内酰胺类抗生素残留、流速、营养、浊度以及其他理化因素的影响。3.定殖于烧伤小鼠伤口内的产ESBL大肠埃希菌可将bla CTX-M基因水平传递给非产ESBL大肠埃希菌。由于伤口类型较多,伤情各有特点,对伤口内bla CTX-M基因转移研究还需深入,如增加切割伤、化学烧伤等的研究,以得到有共性的结论。展望1.在研究水环境产ESBL菌株耐药基因水平转移问题时,增加水中β-内酰胺类抗生素残留浓度、流速、营养条件及其他理化因素,构建bla基因水平转移数学模型以预测水体耐药基因污染程度。2.在后续实验中增加多种伤型,研究细菌混合感染时bla CTX-M基因水平转移及其危害。3.消除质粒是应对产ESBL菌株bla CTX-M基因转移的比较有前景的方法,但目前尚未研发出安全高效的质粒去除剂,因此,合理用药以及研究出简单可靠的从水中去除耐药菌、耐药基因以及β-内酰胺类抗生素的方法应该更为重要。