研究背景和目的：全球原发性肝细胞癌(HCC)的发病率大约占所有肿瘤发病率的6%,每年的年龄调整发病率约为5500-14900/100,000,其中有一半以上发生在中国。作为治愈率最低的一种恶性肿瘤,HCC的死亡率在恶性肿瘤中排第三位,每年导致全球600,000-1,000,000名患者死亡。随着超声、螺旋增强CT、动态MRI等影像分析技术和病理检测技术的发展,肝癌的诊断和治疗手段取得一定进展,但患者的临床结局未获得相应的重大改善。HCC的发生发展是一个由细胞增殖过程失控引起的、多因素参与、多步骤发展的过程,但具体的分子机制尚未明确。对HCC发病机制的进一步研究,尤其是HCC发展过程中多条信号通路的共同基因/分子改变,有利于明确HCC复杂的发生发展过程,寻找有效治疗靶点,也可以为HCC的诊断提供新型的特异性生物标志物。目前已发现与HCC发病机制有关的分子包括p53,β-catenin, TGF-β和视网膜母细胞瘤基因。但仅1/3的HCC可检测出p53突变,β-catenin突变也仅在13.1%HCC发现。此外,我们对HCC发生发展过程中涉及的关键基因也所知甚少。因此,探索有关基因在肿瘤发病机制中的作用影响,可以为寻找新型的HCC诊疗手段奠定基础,对改善HCC患者的临床结局有重要意义。1997年Hey-Chi Hsu等人利用mRNA DD技术成功克隆出一段在原发性和复发性HCC中特异性表达增高的cDNA,与1996年Pilla等人在过度生长综合症(SGBS, Simpson-Golabi-Behmel)患者中用STSS-PCR (sequence tagged sites)得到分离克隆的cDNA完全相同,和OCI-5 cDNA高度同源,命名为Glypican-3 (GPC-3)。Glypican是细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)家族成员,可与多种生长因子相互作用,作为共受体调节生长因子活性,其表达水平变化及调节生长因子的方式具有时间特异性和组织特异性,可以调节形态发生和肿瘤的发生发展。由于通过核心蛋白而不是HS链相互作用,GPC3可根据组织和发育阶段的不同调节不同类型的生长因子,如通过影响IGF-Ⅱ、Hh、BMP2、BMP7和FGF-7信号转导过程调节细胞生长和器官发育,此外,分泌形式的GPC3的作用机制与细胞表面膜型GPC3可能不同。GPC3在卵巢癌、间皮瘤细胞、乳腺癌、胃癌和肺腺癌等多种恶性肿瘤表达下调,但在HCC、恶性黑色素瘤、wilm瘤中表达升高；在胚胎肝组织中呈高表达,在正常成人肝组织中则表达沉默,表达方式与癌胚蛋白相似,且在HCC的发生发展过程中表达逐渐增强,提示GPC3可能与HCC发病和进展有关,不同研究也发现GPC3影响IGF-Ⅱ、Wnt、Hh、FGF、BMP、SMAD、TGF-β等调节肝癌细胞生长和转移侵袭的通路,提示GPC3可能是HCC重要的预后因子和诊断治疗的新型靶点。本研究通过构建GPC3真核表达载体,应用脂质体转染法转染低表达GPC3的肝癌细胞株MHCC97-L,检测观察细胞株在转染前后的生物学行为变化,初步探讨GPC3基因在HCC中发病机制的作用,为GPC3成为HCC诊断、预后、治疗的有效靶点提供理论依据。方法：1.目的基因GPC3的获得参照pDNR-LIB载体上GPC3基因序列设计引物,以通用载体pDNR-LIB-GPC3质粒为模板扩增目的基因,产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯度及相对分子质量,用DNA胶回收试剂盒回收GPC3 DNA片段。2.重组表达载体pEGFR-c3-GPC3的构建将回收的GPC3 DNA片段与经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pEGFP-c3载体按比例混合,做连接反应。3.重组表达载体pEGFR-c3-GPC3的克隆及鉴定将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。设立阴性对照,经卡那霉素抗性平板筛选出阳性克隆后,随机挑取单个阳性克隆,加入含卡那霉素LB培养基,摇菌后质粒小量快速提取pEGFP-c3-GPC3质粒备用,将产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯度及相对分子质量,紫外分光光度计测OD值。用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,新克隆命名为pEGFP-c3-GPC3,所获阳性重组子进行双酶切鉴定及送武汉三鹰生物技术公司进行测序。1.GPC3基因真核表达载体转染人肝癌细胞株MHCC97-L用Lipofectamine2000介导pEGFR-c3-GPC3质粒转染人肝癌细胞株MHCC97-L细胞株后,以G418筛选(200μg/ml)2w以获得稳定表达GPC3基因的MHCC97-L/GPC3细胞克隆。以pEGFR-c3空载体转染的MHCC97-L细胞做对照组。克隆环分离多个克隆分别种于96孔板中,改为G418 (100μg/ml)维持培养。96孔板长满后,转接到24孔板的培养板中传代培养,最后用含100μg/ml G418的完全培养基扩大培养,用于下一步鉴定及生物学实验。2.GPC3基因表达的鉴定和稳定转染细胞的生物学特性的初步观察荧光定量PCR检测GPC3基因在转染细胞中mRNA水平的表达,Western blot鉴定转染后GPC3基因在转染细胞中的蛋白表达水平,通过MTT法,检测GPC3对肝癌细胞MHCC97-L体外增殖能力的影响。结果：1.连入通用载体pDNR-LIB中的GPC3基因序列经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳结果显示可见约1.7Kb的目的片段和约4.1Kb的载体片段,与pDNA-LIB线性质粒和GPC3基因长度一致。2.根据pDNR-LIB中GPC3序列设计引物并进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖电泳后显示约1.7Kb大小的特异性条带。3.回收后的GPC3基因片段与经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后的pEGFR-c3线性质粒连接。连接产物转化感受态细菌DH5α,挑取阳性克隆,质粒小量提取后,对pEGFR-c3-GPC3重组质粒进行双酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果显示约1.7Kb的目的片段和约4.7Kb的载体片段。连接产物经测序鉴定,结果表明与GenBank中GPC3序列完全符合。1.稳定转染pEGFR-c3-GPC3和pEGFR-c3质粒的MHCC97-L细胞株能在G418浓度为200μg/ml的DMEM选择培养基中生长2w,筛选出稳定表达GPC3基因的MHCC97-L/GPC3和作为对照的MHCC97-L/C3细胞。2.荧光定量PCR结果MHCC97-L/GPC3与未转染的MHCC97-L(2-ΔΔCt=1)及MHCC97-L/C3相比,GPC3 mRNA水平有显著上调(95%CI(1.715,1.791)；t=-44.714,P<0.001)。3.Western blot结果分别从MHCC97-L、MHCC97-L/C3和MHCC97-L/GPC3中提取总蛋白经Western blot检测,结果表明MHCC97-L/GPC3的GPC3蛋白水平较MHCC97-L、MHCC97-L/C3在蛋白水平显著升高(P<0.001；P<0.001)。5.采用MTT法检测三组细胞的生长特性,结果表明与转空载体组和未处理组相比,转染GPC3基因的MHCC97-L/GPC3细胞增殖显著加强(P<0.001)。结论：1.本实验成功构建了pEGFR-c3-GPC3真核表达载体,经双酶切鉴定,测序分析证实插入基因序列与GenBank中GPC3序列完全一致。2.重组质粒pEGFR-c3-GPC3转染MHCC97-L细胞株后用G418筛选出了稳定表达GPC3基因的MHCC97-L/GPC3细胞株；经RT-PCR及Western blot检测分析,转染GPC3基因后的MHCC97-L/GPC3细胞在mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高；MTT法绘制生长曲线显示,与未转染的MHCC97-L细胞及转染空载体的MHCC97-L/C3细胞相比,MHCC97-L/GPC3细胞增殖显著加强,提示GPC3基因表达增强能显著促进肝癌细胞株MHCC97-L的增殖。