抗体(antibody)是人类免疫系统的重要组成部分,为机体提供有效的免疫防护。近二十年来,抗体在许多领域的应用越来越广泛,包括环境监测,临床检测及疾病治疗等。随着现代生物学技术的不断发展,所获得的单克隆抗体种类大大增加、临床应用的副作用有了显著改善。单克隆抗体制备技术出现于上世纪七十年代。通过杂交瘤技术获得的抗体是鼠源性的抗体,用于临床治疗时会存在诱发人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody, HAMA)的可能性,并且安全性较差。其应用价值在一段时间里一直备受讨论。随着现代生物学技术的不断发展,所获得的单克隆抗体种类大大增加、副作用有了显著改善。抗体越来越广泛的被利用,包括临床治疗及检测、环境监测等。单克隆抗体的制备技术先后经历了杂交瘤技术、抗体库技术、抗体展示及筛选技术等多个发展阶段。目前较为常用的噬菌体展示等技术,有着实验过程简单,库容量大等优点。但是由于噬菌体展示技术一般只能筛选抗原结合片段(Fragment of antigen binding, Fab)或单链可变区抗体片段(single chain variable Fragment, scFv)等小分子,所以不能通过噬菌体展示技术筛选得到全长的人源抗体；另外,展示系统所使用的宿主细胞为原核细胞,原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同,因此大噬菌体展示技术筛选获得的全长抗体很难在哺乳动物系统中获得高表达。而利用现有的哺乳动物细胞表面展示技术所建立的全长抗体库的库容量仅为106,不足以满足筛选出高特异性抗体的需求；若能够提升抗体库的构建效率,建立大容量的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库,将有利于从中筛选获得高特异性、高亲和力的抗体,从而推动抗体研究的进步。登革病毒感染可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS)。DHF/DSS病情严重,致死率高。因为其感染机制较为复杂,目前尚未行之有效的临床针对性治疗。又因为其由蚊媒传播难以控制,同时缺乏有效的登革疫苗。因此,对筛选出高特异性的登革抗体,不仅是运用于临床治疗药物的开发还是用于疫苗的研制,都有非常重要的作用。甚至对其发病机理的发现,都将大有帮助。本研究使用课题组前期构建成功的哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,通过将全长抗体基因插入载体中,再展示在哺乳动物CHO细胞表面,为以后筛选较理想高特异性登革抗体做铺垫。通过流式分析得到的结果,8个轻链克隆、7个重链克隆均可检测到抗体的表达,细胞阳性率2.8%-41.3%,这与抗体库基因测序结果相一致。理论上获得的抗体多样性达到1.46×109[(1.45×104×80%)×(1.8×105×70%)]。从流式分析结果来看,在没有转染质粒的阴性对照组,CHO细胞背景阳性率只有0.2%,而转染有高效表达的载体阳性对照组,CHO细胞表达达到37.7%,这说明CHO细胞可以作为很好的展示平台。随后将轻链抗体基因和重链抗体基因同时插入到哺乳动物细胞表达载体pDGB4中,构建登革病毒全长人源二级抗体基因库,库容量为2.4×105,背景克隆的比例为1.2%。将其瞬时转染CHO细胞,流式细胞仪检测发现,阳性组为12%,而本研究所建立的登革病毒全长人源二级抗体基因库中有最高有19%的细胞表面成功展示全长抗体并被检查到。一、登革病毒特异性全长人源抗体库的构建目的：应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集确诊的登革热患者恢复期静脉血20ml,置于抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入适量Buffer RLT,裂解细胞,—80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2. cDNA第一链的合成以提取的总RNA为模板,使用轻链全长引物和重链可变区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用相应的特异性引物扩增全套IgGl轻链K型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5min,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。4.PCR扩增产物的分离纯化PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。然后将回收得到的PCR扩增产物,再次经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定以BsmBI对重链基因扩增产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分离纯化目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌DH-5α,构建重链基因库。轻链全长基因的扩增产物经SfiI酶切后回收,与同样经SfiI酶切回收的载体pDGB-HC-TM片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌DH-5α,构建轻链基因库。分别从重链抗体库和轻链抗体库中各随机挑取10个单克隆,摇菌培养过夜后抽提质粒,测序分析抗体基因库的质量及多样性。6.抗体在哺乳动物细胞表面的展示将8个轻链克隆与经鉴定可以高效表达重链的载体pDGB-HC-TM共转染CHO细胞,同时将7个重链克隆分别与经鉴定可以高效表达轻链的载体pDGB-Hu-Kappa共转染CHO细胞。然后用流式分析仪检测分析在CHO细胞表面表达抗体的情况。结果与讨论：我们分别构建了登革病毒抗体轻链基因库和重链基因库。重链基因库实验组的连接转化效率为每微克DNA有1.4x106克隆,无插入片段的背景克隆为0.5%；轻链基因库实验组的连接转化效率为每微克DNA有1×106克隆,无插入片段的背景克隆为1.4%。分别用100ng的重链连接产物和100nng的轻链连接产物转化感受态细菌,构建获得的轻链基因库容量为1.45x104,重链基因库容量为1.8x105。在抗体基因库里的重链库和轻链库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有8个含有正确的VH编码序列,编码8个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有7个含有正确的LCκ编码序列,编码7个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到1.46×109[(1.45×104x80%)×(1.8x105×70%)],可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。将抗体库瞬时转染CHO细胞后,在37%的细胞表面可以检测到全长人源抗体的表达。结论：本研究采用哺乳动物细胞展示技术,成功用哺乳动物细胞表面展示载体pDGB-HC-TM构建了库容量大且多样性好的全长人源抗体基因库,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。二、登革病毒全长人源二级抗体库的构建及展示目的：将第一部分构建好的登革病毒全长人源轻链、重链初级抗体基因库的重链可变区及轻链全长基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,构建一个全长人源的二级抗体库,并将此抗体基因库瞬时转染CHO细胞,全长抗体能够在CHO细胞表面展示。方法：1.双表达载体pDGB4片段的制备用限制酶BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,分离纯化5kb和3kb的两段目的DNA片段。2.抗体库基因的制备以第一部分已经制备的抗体重链基因库的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体重链基因库的质粒DNA；用BsmBI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.45kb的目的DNA片段。以第一部分已经制备的抗体轻链基因库的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体轻链基因库的质粒DNA：用SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.75kb的目的DNA片段。3.DNA片段的连接及感受态大肠杆菌DH-5a的转化用T4DNA连接酶将获得的抗体轻、重链基因库片段与纯化得到的5kb和3kb的两段载体DNA片段进行连接,获得重组pDGB4。转化化学感受态大肠杆菌DH-5a,构建全长人源二级抗体库。4.抗体库在哺乳动物细胞表面的展示将二级抗体库的质粒DNA瞬时转染CHO细胞,用PE标记的鼠抗人kappa链抗体进行细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪进行检测分析。结果与讨论：根据在带有氨苄青霉素抗性LB平皿上长出的克隆数,计算所构建的全长抗体二级基因库库容量为2.4×105,背景克隆的比例为1.2%。用流式细胞仪检测细胞表面可成功展示可被检测的全长抗体。总共挑出来10个克隆,通过瞬时转染CHO细胞,共检测到有4个克隆可以被检测到在细胞表面表达抗体,阳性细胞比例从1.5%到19%不等,说明在同等实验条件下,不同的抗体分子在CHO细胞表面的表达强度不同。这可能是因为不同的抗体分子的氨基酸序列不同引起的表达差异,也可能是由于宿主细胞的活性有微小差异导致。结论：成功将第一部分构建好的初级抗体库基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建了全长人源二级抗体库,并将基因库转染哺乳动物细胞CHO,获得能够哺在乳动物表面展示的全长人源抗体的抗体库,为登革病毒特异性抗体的筛选奠定了基础。