【摘 要】
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背景肿瘤抗原特异性T细胞产品是恶性肿瘤治疗的选择之一。肿瘤组织内以及肿瘤患者外周血中PD-1+T细胞亚群富含更多的肿瘤抗原特异性细胞。我们前期有利用磁珠分选方法扩增此群细胞,但该方法费时、费力且成本高昂。因此,建立一种无需分选的选择性扩增方式,有助于减少分选带来的不利。外泌体（Exosome）能够靶向递送,但产量低,需额外装载步骤。基于此,探究构建靶向细胞程序性死亡蛋白-1（Programmed
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背景肿瘤抗原特异性T细胞产品是恶性肿瘤治疗的选择之一。肿瘤组织内以及肿瘤患者外周血中PD-1+T细胞亚群富含更多的肿瘤抗原特异性细胞。我们前期有利用磁珠分选方法扩增此群细胞,但该方法费时、费力且成本高昂。因此,建立一种无需分选的选择性扩增方式,有助于减少分选带来的不利。外泌体（Exosome）能够靶向递送,但产量低,需额外装载步骤。基于此,探究构建靶向细胞程序性死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）的模拟外泌体纳米囊泡（Nanovesicles,NV）,有助于解决Exosome产量低,需额外装载步骤的缺点,对选择性扩增PD-1+T细胞意义重大。目的建立高产量,无需额外装载步骤的靶向PD-1的NV的制备方式,探究其靶向结合能力及对T细胞增殖的影响。方法1.NV的制备和特性分析挤压法制备NV。利用纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布,透射电子显微镜观察形态,BCA法测总蛋白量,免疫印迹方法检测相关标志物及装载能力。2.OKT3-NV的功能性分析抗人CD3单克隆抗体（OKT3）是常用的过继性细胞培养的刺激因子之一。挤压法制备装载OKT3的NV（OKT3-NV）,密度梯度离心法获取的健康供者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,利用流式细胞术检测OKT3-NV与T淋巴细胞的结合能力。并设置4个细胞培养组:immobile-OKT3组、free-OKT3组、OKT3-NV组和Control-NV组。通过明场显微镜观察细胞扩增,台盼蓝拒染法进行细胞计数,流式细胞术检测扩增获得的T细胞产品的特性。3.a PD-1-OKT3-NV的功能性分析双酶切连接构建含有HA标签序列、anti-PD-1（sc Fv）基因和嘌呤霉素筛选基因的p MXs-HA-dis ND-p TM-IP质粒载体,利用LipofectamineTM 2000使质粒载体转染HEK293T细胞,经嘌呤霉素筛选,获取高表达anti-PD-1（sc Fv）的HEK293T细胞株（293MP）。利用293MP细胞通过挤压法制备装载OKT3的NV（a PD-1-OKT3-NV）,密度梯度离心获取健康供者PBMC,台盼蓝拒染法进行细胞计数分析a PD-1-OKT3-NV对T淋巴细胞的扩增能力,流式细胞术检测a PD-1-OKT3-NV靶向结合PD-1+T淋巴细胞的能力。结果1.通过挤压法可制备与Exosome表征类似,但产量高无需额外装载步骤的NV。2.OKT3-NV体外具有与人T淋巴细胞以浓度和时间依赖性结合的能力。3.OKT3-NV体外可快速扩增人T淋巴细胞,且扩增获得的T细胞产品与常规培养方式获得的T细胞产品在表面受体（趋化因子受体、共刺激和共抑制分子）表达水平、细胞活性（凋亡比例）及效应性（IFN-γ分泌）方面无差异。4.成功构建膜表达anti-PD-1（sc Fv）的HEK293T细胞株（293MP）。5.利用293MP细胞制备装载OKT3的NV（a PD-1-OKT3-NV）,证实anti-PD-1（sc Fv）的存在不影响OKT3-NV的扩增能力。6.a PD-1-OKT3-NV具有靶向结合PD-1分子的能力。结论本研究采用挤压法成功制备与Exosome表征类似,但产量高无需额外装载步骤的NV,巧妙的将具有高T淋巴细胞扩增活性的OKT3装载进入NV（OKT3-NV）,实现了T淋巴细胞的快速扩增,并证实对装载细胞进行表面修饰后制备装载OKT3的NV（a PD-1-OKT3-NV）,对OKT3-NV扩增T淋巴细胞的能力没有影响,且可以靶向结合PD-1+T淋巴细胞,为后续选择性扩增PD-1+T淋巴细胞奠定了基础。
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