狗肝菜多糖分离纯化及保肝作用研究

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狗肝菜为爵床科植物狗肝菜属狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees的全草,具有清热解毒、凉血、生津、利尿等功效,用于治疗肺热咳嗽、咳血、急性肝炎等症。狗肝菜主要成分为多糖,本文就以狗肝菜多糖为研究对象,分离纯化多糖并探讨其保肝作用。主要研究内容如下:1.狗肝菜多糖保肝有效部位筛选。提取狗肝菜总多糖,运用不同截留分子量透析带,采用透析的方法将总多糖分为分子量小于2000Da(小于2kDa)、分子量小于6000Da多糖组(小于6kDa组),分子量大于6000Da小于10000Da多糖组(6k-10kDa组)和分子量大于10000Da多糖组(大于10kDa组),建立扑热息痛、酒精致小鼠急性肝损伤和D-半乳糖胺致大鼠急性肝损伤模型,测定动物血清ALT、AST,肝组织GSH、GST、SOD、GSH-Px,结合肝组织病理学检查,确定其有效部位。结果显示:(1)扑热息痛致小鼠急性肝损伤模型中,与模型组对比,狗肝菜多糖各给药组能降低血清中ALT、AST含量(p<0.01或p<0.05),各给药组均能明显降低肝匀浆中的MDA,升高肝匀浆中的GSH和SOD活力(p<0.01或p<0.05)。(2)酒精致小鼠急性肝损伤模型中,与模型组对比,狗肝菜多糖各给药组能降低血清中ALT、AST含量(p<0.01或p<0.05),能显著降低MDA含量(p<0.01),提高GST活力(p<0.05)。(3)D-半乳糖胺致大鼠急性肝损伤模型中,与模型组相比,狗肝菜多糖各给药组能降低血清中ALT、AST含量(p<0.01或p<0.05),能显著降低MDA含量(p<0.01),提高GSH-Px活力(p<0.05)。病理组织学观察发现狗肝菜多糖各给药组能不同程度改善肝细胞肿胀,脂肪变性和肝细胞坏死,其中以小于6kDa组作用最明显。2.狗肝菜多糖分子量小于6kDa部位抗肝纤维化研究。采用四氯化碳腹腔注射方法,每隔3天一次,共8周制作大鼠肝纤维化模型,设立正常组、模型组、甘草甜素组(30mg/kg)、复方鳖甲软肝片组(600mg/kg)、狗肝菜多糖分子量小于6kDa组(小于6kDa组,120mg/kg)、甘草甜素与多糖联用组((30+120)mg/kg),每天给药,8周后处死大鼠,留取大鼠肝脏和血清测定相关指标。结果显示:与模型组相比,各给药组均能显著降低血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量(p<0.01),降低肝组织匀浆中Hyp、TGF-β1含量(p<0.01或p<0.05)。病理组织学检查采用HE染色和Masson染色,结果显示各给药组肝纤维化均有不同程度的改善,纤维间隔变窄,结缔组织增生减少,炎性浸润程度减轻,其中以联用组最为明显,脂肪变性基本消失,肝组织结构趋向正常。3.狗肝菜多糖分子量小于6kDa部位的分离纯化。分子量小于6kDa多糖经DEAE-52阴离子交换柱梯度洗脱,分离得到四个组分:P1、P2、P3、P4。四个组分分别经SephadexG-50凝胶柱层析进一步纯化,分别得到四个亚组分:P1A、P2A、P3A、P4A。凝胶渗透色谱测定分子量得出四个亚组分分子量分别是:2339Da、1674Da、2374Da、4999Da。单糖组成结果显示:P1A和P3A均含有6种单糖,分别是rha,ara,xyl,man,glu,gal;P2A含有5种单糖,分别是rha,ara, man,glu,gal;P4A含有4种单糖,分别是rha,man,glu,gal。4. P1A组分的结构分析。通过部分酸水解、高碘酸氧化和Smith降解、IR、1H-NMR及13C-NMR分析结果推断:P1A的主链单糖残基为鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,末端残基和分支单糖残基为阿拉伯糖和木糖;P1A中含有能产生甲酸的1-、1,6-键型和非还原末端,也含有可消耗NaIO4不产生甲酸的l,2-和1,4-键型,此两种键型比例大约为1:2。可氧化键型占45%,不可氧化键型主要是1,3-键,占55%。由Smith降解分析得P1A中甘露糖、葡萄糖、半乳糖,主要以1→3糖苷键相连;鼠李糖、阿拉伯糖、木糖主要以l,2→和1,4→键型相连。由核磁共振分析得P1A含有几个片段,分别是:β-L-Ara-OMe,β-Glc(1,6)-,β-Gal(1,3)-,β-Man(1,4)-β-Rha。
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