Arrestins是一组具有重要作用的蛋白。它可调节G蛋白偶联受体的下游信号转导。Arrestin同G蛋白偶联受体的结合使G蛋白介导的信号通路被阻断,且介导G蛋白偶联受体的内吞；Arrestin还启动新的非G蛋白依赖的信号途径,例如ERK和Src等信号途径。除了结合GPCR, arrestin可以同许多细胞表面受体家族及多种信号途径蛋白结合。哺乳动物表达arrestin的四种亚型,其中P-arrestin-1和P-arrestin-2的表达在哺乳动物中十分广泛,并且具有十分重要的功能。为了研究β-arrestin-1和β-arrestin-2的生理功能,β-arrestin-1和β-arrestin-2两种基因敲除小鼠被广泛应用。目前,应用β-arrestin-1和β-arrestin-2的基因敲除小鼠,研究许多生理问题：G蛋白偶联受体受到相关激素或配体刺激后,下游信号的转导和调控；各系统器官的发育及功能的维持；各种疾病及外界环境刺激所致疾病的转归等。其中较多的研究结果来自于β-arrestin-2基因敲除小鼠,而对β-arrestin-1基因敲除小鼠的研究较少。本实验室的前期胰岛p细胞系MIN6细胞实验表明,β-arrestin-1在硫化缩胆囊素八肽(CCK-8s)抗p细胞凋亡中发挥着重要作用；为了研究CCK-8s对原代胰岛p细胞的作用,我们通过β-arrestin-1的敲除小鼠的胰岛和胰岛p细胞,证实了β-arrestin-1在CCK-8s结合CCK1受体进而促进胰岛素分泌及抗胰岛p细胞凋亡中的作用。研究胰岛p细胞中CCK1受体激活后不同下游通路的偏向性,对开发新的抗糖尿病药物奠定了基础。[研究目的]运用β-arrestin-1敲除小鼠,研究CCK-8s对胰岛p细胞凋亡和胰岛素分泌的作用及机制。[研究方法]1.实验用基因敲除小鼠及野生型小鼠的准备(1) 纯合敲基因小鼠同C57小鼠的回交。(2) F1代杂合小鼠的选育及配种。(3) 逆转录PCR区分野生型及非野生型F2代小鼠。(4) 实时定量PCR区分F2代杂合及纯合小鼠。(5) 以上述方法扩大种群数量,选取同窝野生及纯合基因敲除小鼠进行动物实验。2.动物实验(1) 使用ELISA试剂盒检钡β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰岛给予CCK-8s后胰岛素分泌的变化。(2) 使用ELISA试剂盒检测β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰岛给予CCK-8s后IP3, cAMP的变化。(3) P-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠STZ糖尿病造模,期间给予CCK-8s,验证β-arrestin-1同CCK-8s保护作用是否相关。(4) 用蛋白印记分析技术(Western blot)检测β-arrestin-1敲除小鼠和野生C57小鼠胰岛抗凋亡途径。[研究结果]P-arrestin-1基因敲除小鼠的胰岛同野生型小鼠胰岛相比,在受到CCK-8s刺激后,分泌胰岛素的量减少。P-arrestin-1基因敲除小鼠的胰岛同野生型小鼠胰岛相比,CCK-8s通过激活CCKI受体引起cAMP的累积效应下降。CCK-8能改善STZ糖尿病造模的C57野生型小鼠的葡萄糖耐量,但不能改善β-arrestin-1敲除小鼠经STZ糖尿病造模后的糖耐量。Western blot显示,β-arrestin-1基因敲除小鼠的胰岛同野生型小鼠胰岛相比,CCK-8s引起p90RSK-phosphor-Bad信号通路的激活被明显抑制。[结论]β-arrestin-1在CCK-8s通过CCK1受体所引起的胰岛p细胞胰岛素的分泌和对p细胞抗凋亡过程中具有十分重要的作用。