肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。而其中非小细胞肺癌(NSCLC)占到85%。虽然近年来新技术层出不穷,对恶性肿瘤的诊治水平得到长足的进步,但是非小细胞肺癌患者的总体5年生存率仍不容乐观。究其原因,主要是非小细胞肺癌发生、发展比较隐匿,很多患者在发现病灶时就已经是中、晚期。因此,进一步阐明肺癌的发生、发展的分子机制,提供新的治疗靶点,从而提高肺癌诊治水平具有重要意义。USP7,又称为疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶(HAUSP),最初是被确定为疱疹病毒相关的细胞因子,随后的研究发现它能去泛素化并能稳定抑癌基因p53。此外,USP7能调节细胞内众多蛋白的活性,这些蛋白包括抑癌基因、DNA修复蛋白、免疫因子、病毒蛋白等。最近的研究表明USP7在前列腺癌中表达上调并且与其肿瘤进展密切相关,而在耐药性多发性骨髓瘤中,抑制USP7能诱导骨髓瘤细胞的凋亡。在动物模型中,敲除USP7后的裸鼠胚胎显示出p53的激活和细胞生长暂停并最终导致胚胎死亡。这一系列证据表明USP7在肿瘤细胞中的表达失调可能与恶性肿瘤的进展密切相关。但USP7在是否在非小细胞肺癌发生、发展中起作用尚未有明确报道,其在非小细胞肺癌中的表达和功能及机制仍需进一步研究。因此,本实验通过检测非小细胞肺癌内USP7的表达,探究其与非小细胞肺癌发生、发展及预后的相关性；并通过干扰USP7表达,探讨USP7在非小细胞肺癌中的具体功能及机制。第一部分USP7在非小细胞肺癌细胞株及组织中的表达研究首先,我们通过western blot检测非小细胞肺癌细胞株(H460、A549、H1299、 H1355、95D、95C)及正常支气管上皮细胞株16HBE中USP7的表达。其次,我们通过荧光定量PCR及western blot检测12对非小细胞肺癌组织及相应癌旁正常组织内USP7的表达情况。结果表明：无论在细胞水平还是组织水平,USP7在非小细胞肺癌内的表达均显著高于正常细胞和组织,提示USP7有可能参与了非小细胞肺癌的发生、发展。第二部分干扰USP7对非小细胞肺癌细胞株生物学功能的影响为研究USP7与非小细胞肺癌各种生物学功能间的关系,我们建立三个USP7敲除的非小细胞肺癌细胞稳定株H460-shUSP71#、2#、3#,检测三个稳定细胞株中USP7的敲除效率,结果显示sh 2#效率最高,差异有统计学意义。遂采用H460-shUSP72#进行进一步实验。通过CCK-8、克隆形成实验、凋亡实验、及Transwell实验进一步研究干扰USP7后对非小细胞肺癌细胞株各种生物学功能的影响,并进一步通过裸鼠皮下移植瘤体内实验进行验证。结果表明：干扰USP7后显著抑制非小细胞肺癌细胞株H460的增殖能力、克隆形成能力、成瘤大小及侵袭转移能力,并能促进细胞凋亡。进一步证实USP7可能参与非小细胞肺癌的进展。第三部分USP7表达与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系鉴于细胞和组织水平的结果,我们进一步通过免疫组化技术检测组织芯片内209例非小细胞肺癌患者的USP7的表达情况,研究其与肺癌临床病理特征及预后的关系,从而探究USP7的表达是否与非小细胞肺癌患者的预后有关。结果表明：USP7的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移、肿瘤分期、肿瘤大小显著相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示：肺癌分期、淋巴结转移、肿瘤直径>3cm及USP7高表达患者总体生存率(Overall Survival,OS)低,Cox多因素分析提示USP7高表达、淋巴结转移及肿瘤大小是患者的独立预后因素。第四部分USP7促进非小细胞肺癌进展的机制研究USP7是如何促进非小细胞肺癌发生、发展呢?已知USP7主要参与调解p53-MDM2通路,而p53参与激活细胞线粒体凋亡通路,为探讨USP7在肿瘤细胞凋亡通路中的具体机制,我们通过干扰USP7后,western blot检测p53,MDM2及线粒体凋亡相关分子Bcl-2家族蛋白的表达。此外,第二部分已经证实USP7能促进肺癌细胞的侵袭转移,而近年来研究表明,EMT在肿瘤细胞的侵袭转移中起关键作用,USP7是否参与EMT过程还需进一步研究证实。因此,我们通过干扰USP7的表达来探讨USP7促进非小细胞肺癌进展的机制。结果表明：首先,干扰USP7后,非小细胞肺癌细胞株H460内的p53表达水平明显上调,而MDM2表达明显降低,同时,Bcl-2家族中的促凋亡蛋白磷酸化Bad表达明显下调,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达明显下调。说明USP7介导肺癌细胞的抗凋亡活性有赖于p53的失活,而在线粒体水平则有赖于促凋亡蛋白Bad的磷酸化水平。其次,干扰USP7后,H460细胞的上皮表型标志物E-cadherin表达明显上调,而问质表型Vimentin和N-cadherin表达明显下调,说明USP7可能通过参与EMT的过程,从而促进非小细胞肺癌的进展。