在雄性哺乳动物睾丸内持续的精子发生是维持其生殖能力的必备条件。精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是精子发生的基础,既可以逐级分化最终产生有功能的成熟精子,又可以自我更新维持其干细胞的数量。体外对SSCs进行分离纯化、培养及其它操作技术的建立为精子发生过程、雄性辅助生殖、细胞再生治疗和遗传学的研究开辟了新的道路。鉴于SSCs具有多种潜能和应用前景,极具研究价值,本研究对大鼠SSCs进行了系统且完整的分离纯化、长期培养以及体外分化能力的研究。之所以选择大鼠为研究对象是因为大鼠作为模式动物,能为哺乳动物SSCs的特性和机理研究提供更多便利和资料。此外,大鼠还具有其他优势,如大小、繁殖力、易于手术处理、取样方便和便于实验管理等,使其成为特别有吸引力的动物模型,将为人类健康和疾病的研究提供更多的生理及临床研究数据。此外,构建可在睾丸SSCs中特异表达荧光蛋白标记的质粒载体,将能够很方便地辨认SSCs,使得SSCs在体内外关于增殖和分化的动态变化直观地表现出来,这将大大便利于SSCs的特性和功能的研究。为此,本研究制备了在睾丸SSCs中特异表达红色荧光蛋白的质粒载体,若能联合精原干细胞移植技术,制备转基因大鼠,预计该转基因大鼠将在SSCs中特异表达红色荧光蛋白,为后续SSCs体内外的研究提供实用的细胞模型和动物模型。1.大鼠精原干细胞的分离和纯化本研究以22-25天Wistar-Iamichi大鼠为研究对象,利用两步酶消化法分离得到睾丸曲细精管细胞悬液,根据精原干细胞与曲细精管细胞悬液中体细胞(支持细胞及少量的管周细胞)及各级分化的生精细胞贴壁能力及对细胞外基质粘附力的不同,将大鼠精原干细胞进行纯化。经纯化后5只大鼠的睾丸约可以得到3×105个SSCs。利用该方法分离和纯化大鼠SSCs,操作简便,且得到的SSCs具有很高的活力和增殖能力,是一种高效的分离纯化方法。2.大鼠精原干细胞的体外长期培养本研究建立了大鼠SSCs体外长期培养系统,该系统以丝裂霉素处理的STO (SIM mouse embryo-derived thioguanine and ouabain resistant)细胞为滋养层,使用无血清、培养成分明确的培养液,添加GDNF (basic fibroblast growth factor), bFGF(glial cell line-derived neurotrophic factor), GFRα1(GDNF-family receptorα1)三个重要生长因子。在该培养体系中,大鼠SSCs连续培养超过6个月,传代超过30代,葡萄串状的SSCs细胞克隆形态保持不变。该SSCs可在体外任意培养时期进行冷冻保存,解冻后可迅速恢复生长。该体系的稳定建立,为日后大鼠SSCs的研究和应用奠定了扎实的基础。3.体外长期培养大鼠精原干细胞的鉴定本研究运用睾丸冰冻切片免疫荧光染色和曲细精管整段免疫荧光染色对大鼠睾丸内SSCs的位置分布及形态进行了检测,并证实实验所用标记基因CDH1, GFRal, PLZF是可靠的大鼠SSCs的标记基因。对长期培养的大鼠SSCs进行分子水平的鉴定。经细胞免疫荧光分析可见,培养的大鼠SSCs同时表达CDH1,GFRα1和PLZF三个SSCs标记基因的蛋白质产物。RT-PCR分析证实了CDH1,GFRal,PLZF在长期培养的大鼠SSCs中转录表达,同时还证实了其他SSCs标记基因c-kit, POU5fl, C-Ret的转录表达。该鉴定技术简便、可靠,可用来鉴定体外长期培养的SSCs,为日后SSCs的后续研究奠定了基础,并为家畜等大动物SSCs体外鉴定提供了借鉴。4.大鼠精原干细胞体外分化功能的鉴定在该体系中,体外长期培养的大鼠精原干细胞与睾丸体细胞共培养,采用MEMα+10%FBS培养液,并添加促卵泡激素(FSH)和睾酮,在34℃,5%CO2和饱和湿度条件下进行体外分化培养。该培养体系在开始培养的24h之内,精原细胞大量死亡,之后逐渐稳定,培养两周左右的时间可以观察到精母细胞,培养三周后可观察到体积较小的精子细胞。该研究证实体外长期培养的大鼠SSCs是有生理功能的,同时该体系的建立也为在体外深入进行大鼠精子发生研究奠定了基础。5. SSCs特异标记基因表达载体的构建该载体采用CDH1启动子。CDH1已经被证实是小鼠和大鼠SSCs的标记分子。本研究采用无启动子的基础载体pDsRed2-1,在其多克隆位点插入CDH1启动子驱动红色荧光蛋白基因DsRed2的表达,在其相反方向插入了CMV-EGFP基因表达框,期待转染细胞后能在所有细胞中表达绿色荧光蛋白,而在SSCs中表达红色荧光蛋白,便于后续实验的检测。经人肝癌细胞系HepG2细胞转染实验证实,本研究成功构建了含有CDH1-DsRed和CMV-EGFP双荧光蛋白基因表达框的质粒载体。