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辣椒(Capsicum annuum L.)作为我国重要的蔬菜,是一种典型的土传病害多的茄科作物,常常发生病害,特别是在高温高湿条件下,病害频发且严重,影响辣椒产量和品质。研究辣椒抗病分子机制,有利于开展辣椒抗病遗传改良和培育抗病新品种。作为在高等植物中成员种类最多的转录因子家族成员之一,WRKY转录因子广泛地参与到植物各种生理生化过程的转录和调节当中,特别在植物对各种外源病原菌入侵及其它生境逆境防御反应的响应调节中发挥了重要的作用,剖析WRKY转录因子中各个成员在植物的抗病或耐逆中所存在的作用,是研究植物抗病或耐逆相关分子调控机制的重要内容以及可行方案。虽然前人研究发现CaWRKY6,CaWKRY27,CaWRKY40和CaWRKY58等辣椒WRKY家族成员在辣椒应答其重要土传病原菌青枯菌接种(RSI)或高温高湿(HTHH)逆境胁迫中起作用,但其分子仍不是很清楚。本研究通过酵母双杂交,分离获得CaWRKY40的互作蛋白CaWRKY71,并对Ca WRKY71的表达以及CaWRKY71与CaWRKY40互作在辣椒应答青枯病中的作用进行了研究,主要结果如下:(1)序列分析表明,Ca WRKY71含有长度为993 bp、编码331个氨基酸残基多肽的开放阅读框,其推导氨基酸序列与其在马铃薯、番茄、烟草、水稻等植物中的同源基因分别有90%,86%,78%,78%,34%的序列同源性。通过在本生烟草叶片上进行基于农杆菌渗透处理的Ca WRKY71-GFP瞬间表达,结合激光共聚焦显微镜观察,结果发现CaWRKY71主要定位在植物细胞的细胞核内。(2)Real-time RT-PCR分析表明,CaWRKY71在辣椒植株中可应答青枯菌侵染,而且还发现该基因的转录表达可被外源水杨酸(SA)和乙烯利(ETH)处理的诱导。(3)通过病毒诱导基因沉默(VIGS)使辣椒植株中的Ca WRKY71发生沉默,导致辣椒植株对青枯菌侵染的敏感性提高,同时也使辣椒抗病相关的标记基因CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1等表达下调。(4)基于农杆菌渗透的35S::CaWRKY71在辣椒叶片上进行瞬间表达,发现Ca WRKY71瞬间超表达触发辣椒叶片出现明显细胞坏死现象,表现为颜色很深的台盼蓝染色和DAB染色以及较高的离于渗漏,且显著提高CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1等抗病表基因的转录表达水平。而在辣椒叶片上进行35S::CaWRKY71-SRDX(嵌合负调节突变体)瞬间表达后则没有明显效果。(5)通过免疫共沉淀(CoIP)和双分子荧光互作(BiFC)验证了CaWRKY71与CaWRKY40的互作关系,并发现其互作发生在细胞核内。在辣椒植株上瞬间表达35S::CaWRKY71,通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析发现了 CaWRKY71与CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1等含W-盒的基因启动子直接结合,青枯菌接种可促进上述结合。但是,Ca WRKY40的沉默导致CaWRKY71与CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1启动子结合能力明显减弱。说明Ca WRKY71能够直接调节CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1等防御反应相关基因的表达,并且Ca WRKY40对CaWRKY71调节CaPR1、CaNPR1、CaDEF1和CaABR1等基因的表达有显著的正调节作用。(6)在辣椒植株上分别过表达CaWRKY71和Ca WRKY40均可显著提高接种辣椒叶片离子渗漏率和细胞HR坏死程度;而同时过表达Ca WRKY71以及Ca WRKY40相对于其各自单独瞬间表达可显著提高离子渗漏率和细胞HR坏死程度,与此相应的是,防御反应相关基因CaPR1、CaNPR1、CaDEF1、CaABR1等的相对转录表达水平相比于单独过表达Ca WRKY71以及CaWRKY40得到显著提高。(7)ChIP-PCR分析发现在Ca WRKY40沉淀下来的DNA中含有Ca WRKY71启动子上W-box的存在,这表明CaWRKY40能直接结合Ca WRKY71的启动子。Real-time qRT-PCR检测结果表明,Ca WRKY40的瞬间过表达可显著性的提高Ca WRKY71的转录表达水平,这说明了 CaWRKY40能直接结合Ca WRKY71启动子上的W-box,并且促进CaWRKY71的表达;而Ca WRKY71沉淀下来的DNA中无Ca WRKY40启动子片段的存在。利用real-time qRT-PCR检测Ca WRKY40的转录表达水平,结果发现过表达CaWRKY71后Ca WRKY40的表达水平有所增强。以上结果说明Ca WRKY71能间接促进Ca WRKY40的表达。综上所述,CaWRKY71和CaWRKY40在表达上和功能上彼此关联,构成WRKY反馈环(feedback loop)在辣椒应答青枯菌侵染的防御反应中起重要调节作用。