【摘 要】
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铅是一种稳定不可降解、人体非必需的重金属,因其良好的应用特性而被各行业广泛使用,但同时也成为影响环境和人类健康的极大威胁。因此,寻找安全且具备排铅功效的天然产物对防治铅中毒有着重要意义。有研究表明含有巯基的天然蛋白质及多肽具有较强的反应活性,可与铅离子发生螯合反应从而减轻铅对人体的危害。而亚麻籽蛋白作为内蒙古地区的优势植物蛋白资源,其氨基酸组成均衡符合WHO/FAO标准,是一种优质的植物蛋白,其氨
【基金项目】
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国家自然科学基金(31860423):亚麻籽蛋白酶解肽抑制胆固醇吸收的生物学功效及其机制的研究; 内蒙古科技计划重点项目(2020GG0064):特色植物蛋白资源高效开发利用关键技术研究; 内蒙古自治区研究生教育创新计划资助项目(SZ2020084):亚麻籽肽的铅螯合作用及其对大鼠慢性铅中毒的影响;
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铅是一种稳定不可降解、人体非必需的重金属,因其良好的应用特性而被各行业广泛使用,但同时也成为影响环境和人类健康的极大威胁。因此,寻找安全且具备排铅功效的天然产物对防治铅中毒有着重要意义。有研究表明含有巯基的天然蛋白质及多肽具有较强的反应活性,可与铅离子发生螯合反应从而减轻铅对人体的危害。而亚麻籽蛋白作为内蒙古地区的优势植物蛋白资源,其氨基酸组成均衡符合WHO/FAO标准,是一种优质的植物蛋白,其氨基酸组成中含有巯基的半胱氨酸占比也相对较高,具有制备富含巯基亚麻籽肽及防治铅中毒的潜力。但能否制备出具有防治铅中毒功效的富含巯基亚麻籽肽尚不清楚,因此本文以低温脱脂亚麻籽饼为原料,首先探讨了富含巯基的亚麻籽肽的制备工艺,初步探究了其与铅离子的螯合能力,在此基础上对其结构进行表征,而后通过分子对接的方法对其与铅离子的螯合机制进行分析,最后探究了富含巯基亚麻籽肽对慢性铅中毒小鼠的保护作用。旨在为亚麻籽肽预防铅中毒方面提供基础理论依据。主要研究结果如下:1.首先以低温脱脂亚麻籽饼为原料,利用碱溶酸沉法制备亚麻籽蛋白,以酶解温度、pH、酶解时间、酶添加量、料液比作为考察因素,巯基含量作为评价指标,通过单因素实验和正交实验对其酶解工艺进行优化,结果表明:最佳酶解工艺条件为采用木瓜蛋白酶在料液比1:60(g/m L)、pH 7.0、酶解温度55℃、酶添加量3%的条件下酶解4.0 h,在此条件下获得的亚麻籽蛋白酶解物的巯基含量最高,为16.69μmol/g;采用Thiopropyl Crystarose 6 Fast Flow共价色谱对亚麻籽蛋白酶解物中含巯基的肽段进行选择性吸附并洗脱收集,得到了巯基含量为71.13μmol/g的富含巯基亚麻籽肽(TCPs);初步探讨了TCPs的铅螯合能力,结果表明TCPs的铅螯合量为23.90mg/g。氨基酸分析表明,相较于亚麻籽蛋白,TCPs中含巯基的半胱氨酸含量增加了2.96倍。采用MALDI-TOF-MS/MS技术从TCPs中鉴定出四种含有巯基的亚麻籽肽,其氨基酸序列为肽Ⅰ:GQQSQHFDSCCDDLKQLR;肽Ⅱ:QGGQGQQQQCEKQ IQEQDYLR;肽Ⅲ:EVERWVQQAKQVARDLPGQC;肽Ⅳ:SCQQFLWEKVQKGG R,其中,肽Ⅰ含有2个半胱氨酸残基即含有2个巯基,肽Ⅱ~肽Ⅳ均含有1个半胱氨酸残基即含有1个巯基,表明已制备到富含巯基的亚麻籽肽。2.采用分子对接技术对肽Ⅰ~肽Ⅲ的铅螯合特性进行分析。结果表明:肽Ⅰ提供的Cys11位点、肽Ⅱ提供的Cys20位点和肽Ⅲ提供的Cys10位点均能提供硫原子与铅离子进行螯合,说明巯基在肽Ⅰ~肽Ⅲ与铅离子螯合的过程中发挥着主要的作用。此外,肽Ⅰ中Asp8、Ser4和Phe7位点可提供氧原子,His6位点可提供氮原子作为铅离子螯合位点与铅螯合,肽Ⅱ中Leu16、Pro17位点可提供氧原子作为铅离子螯合位点与铅螯合,肽Ⅲ中Glu11、Gln17、Arg21可提供氧原子、Glu16位点也能提供氧原子和氮原子作为铅离子螯合位点与铅螯合。3.进一步通过慢性铅中毒小鼠实验探究了TCPs对慢性铅中毒小鼠的保护作用。结果表明:TCPs能促进慢性铅中毒小鼠的生长发育,同时能够显著促进铅在小鼠粪便中的排出;TCPs能有效降低肾功能指标尿素氮、肌酐和尿酸及肝功能指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平;TCPs还能显著提高抗氧化酶超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性,减少丙二醛的过量释放,表明TCPs还起到了一定的抗氧化作用;肝脏、肾脏的组织病理学结果也显示TCPs对小鼠肝、肾的保护作用。总之,TCPs能促进慢性铅中毒小鼠体内铅的排出,还能发挥一定的抗氧化作用,进而降低了铅诱导的毒性作用。本研究为TCPs预防铅中毒方面提供一定的基础理论依据。
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