拳卷地钱中黄酮类化合物的分离纯化、结构表征及生物活性研究

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论文在整理大量文献、调查药材资源的基础上,以苔藓植物地钱中药用活性成分为目标,对广西产拳卷地钱(Marchantia convoluta Gaoet chang)进行了生药鉴别及化学成分的分析、提取、纯化、分离与生物活性研究,从苔藓植物拳卷地钱中提取分离了一类具有明显生物活性的成分—黄酮类化合物。系统地研究了拳卷地钱中黄酮类化合物的提取、纯化、分离的工艺条件,所得到的黄酮类化合物单体通过HPLC、UV、IR、HNMR、MS、HPLC-MS等仪器手段进行定性、定量分析,确定了其结构,并提出了固相萃取法分离黄酮类化合物的模型。生物活性实验研究发现拳卷地钱总黄酮具有明显的抗乙型肝炎病毒、保护肝功能、抑菌、抗炎、利尿等作用,在此基础上进行了拳卷地钱总黄酮注射液的研制。为开发拳卷地钱新药提供了实验依据与基础。具体内容摘要如下: 1.样品调查及鉴别。根据产地调查、标本采集和生药鉴定,查明广西境内3种地钱属植物,分别是地钱Marchantia polymorpha、拳卷地钱Marchantia convoluta以及粗裂地钱Marchantia paleacea,以拳卷地钱为主。在原植物形态、药材性状、显微构造、理化鉴定和紫外光谱、指纹图谱方面进行了研究,并提出了上述3种地钱的鉴别方法。通过系统预试验初步查明拳卷地钱所含化学成分类型,应用GC-MS技术分析其挥发油中成分,通过硅胶柱层析分离其脂溶性部位得到β-谷甾醇和豆甾醇2个植物甾醇成分。 2.黄酮类化合物的含量测定。采用改进的铝盐显色可见分光光度法测定地钱中总黄酮含量,研究了最大吸收波长、显色剂的加入量、显色时间等条件对拳卷地钱总黄酮含量测定的影响,得到最佳测定条件:NaNO2-AlCl3为显色剂,显色时间15 min之内,测定波长525nm,拳卷地钱总黄酮含量与吸光度符合校准曲线Y=-0.0153+0.03003X,加标回收率在97.61%~101.59%之间,平均加标回收率达99.28%,精密度高(RSD=1.1%,n=5)。该法操作简便、快速,数据可靠,可以作为拳卷地钱总黄酮含量的测定方法。 3.总黄酮提取。采用正交试验,研究了温度、乙醇浓度、提取时间、料液比和提取次数对拳卷地钱中总黄酮的提取率的影响,得到拳卷地钱中总黄酮的最佳提取条件:温度为70℃,时间0.5小时,提取次数3次,提取溶剂为80%的乙醇,料液比为1:15,提取率达1.90%。并将酶解法用于地钱总黄酮的提取,得到最佳提取条件:当地钱用量为1g/20mL H2O时,提取介质中酶一1浓度为0.2mg/mL,酶解温度50℃,pH二4.5,酶解时间120min,总黄酮浸出率达1.96%。酶解法提取拳卷地钱总黄酮不用有机溶剂,节约成本;反应温度低,降低了生产能耗。 4.黄酮类化合物单体的分离鉴定。采用固相萃取法分离制备黄酮类化合物的单体,高效液相色谱法跟踪测定纯度,理化方法结合UV、IR、HNMR、MS、HPLC一MS等仪器手段进行结构表征,从拳卷地钱中分离鉴定得到三个单体,分别为5一经基一7一甲氧基一2一甲基色原酮(I)、7一轻基黄酮(lI)和芹菜素一7一O一p一D一葡萄糖醛酸贰(m),以上单体均为首次从广西产拳卷地钱中分离得到;以芹菜素为例,建立了固相萃取法分离黄酮类化合物的模型,从固相萃取填料的选择、萃取溶剂的选择、萃取溶剂的比例、上柱方式、洗脱方式等方面进行了探讨,得到了最佳分离条件,探讨了固相萃取分离黄酮类化合物的共性问题。 5.黄酮类化合物HPLC分析。建立了反相高效液相色谱法测定拳卷地钱黄酮类化合物含量的方法:以乙酸一甲醇一乙睛一磷酸一水为多元混合流动相,等度洗脱,在30 min内对地钱的黄酮提取物直接进行分离与测定,检测波长为350nm,流速0.60 mL/min,采用校准曲线法对实际样品中的芹菜素、棚皮素和木犀草素进行定量分析。实验结果表明:本方法平均加标回收率%.79一101.13%,相对标准偏差0.“%一1.52%。该法可用于拳卷地钱黄酮提取物的精确分析。 6.总黄酮的生物活性实验研究。在抗乙肝病毒体外实验中,拳卷地钱总黄酮在5种不同药物浓度时对朋sAg和HBeAg均有明显抑制作用。拳卷地钱总黄酮高剂量组和联苯双酷组能显著降低CCI;所致急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性,并能升高TP和ALB含量。拳卷地钱总黄酮对大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎杆菌、乙型溶血性链球菌、肺炎双球菌的最低抑制菌浓度(MIC)分别为2.50、0.625、0.625、2.50、2.50、1 .25 mg/mL。拳卷地钱总黄酮高剂量组对二甲苯引起小鼠耳郭肿胀具有明显的抑制作用。结果提示拳卷地钱总黄酮在体外实验和动物模型中,具有明显的抗乙肝病毒,保肝降酶作用;并具有抗菌、抗炎作用,以及对大鼠具有明显的利尿作用。 7.总黄酮抗乙肝病毒的体外细胞实验研究。通过研究发现:拳卷地钱总黄酮对HBsAg和HBeAg具有很强的抑制作用,并抑制HBV一DNA复制和表达。5抖留mL、10林g/mL、20“g/mL、40“g/mL的拳卷地钱总黄酮用药3天后对HBsAg、HBeAg的抑制率分别是100林g八nL拉米夫定抑制率的1.29倍、1.80倍、1.85倍、1.96倍和0.76倍、0.65倍、1.19倍、1.22倍。拳卷地钱总黄酮的抑制抗原半数有效浓度IC50分别为35 .45林留mL、28.77林g/mL、17.11林g/mL。高剂量拳卷地钱
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