类胡萝卜素是广泛存在于自然界中的一种类异戊二烯物质,具有重要的生物学功能,作为食品着色剂的同时具有抗氧化、抗癌、降低白内障等药用价值。掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)类胡萝卜素合成途径包括黄色支路(β-胡萝卜素)和红色支路(圆酵母素和红酵母红素)两种。其中红色支路中圆酵母素和红酵母红素属于真菌特有类胡萝卜素,具有极性强、颜色鲜艳等特点,并且其抗氧化能力优于黄色支路中β-胡萝卜素。因此,本研究通过优化培养基配方和培养条件,以增加掷孢酵母中圆酵母素和红酵母红素含量。掷孢酵母类胡萝卜素合成途径中的三个关键酶CrtE、CrtYB和CrtI的表达调控会使其最终积累色素不同。CrtE是GGPP合成酶,可以合成次级代谢产物前体GGPP;CrtI是八氢番茄红素脱氢酶,在类胡萝卜素合成过程中具有脱氢功能;而CrtYB(八氢番茄红素合成酶-番茄红素环化酶)中环化酶结构域是否参与圆酵母素合成还尚未清楚。本研究通过截短试验,对该酶的关键位点和催化结构域进行分析。主要结论如下:(1)优化后的培养基配方为葡萄糖20.0 g、硫酸铵5.0 g、硫酸镁0.5 g、酵母浸粉0.2 g、磷酸二氢钾1.0 g,培养温度28℃,0.1 M磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液控制p H 6.0,最终获得圆酵母素含量为747.94μg/L,红酵母红素含量为783.41μg/L。(2)掷孢酵母NGR在YPD、YAD及YAD优化培养基中基因crt E、crt YB与crt I的表达存在差异。YAD优化的crt I的基因表达量比YAD高17%,但crt YB的表达量降低为YAD的21%,并且测得YAD优化培养基中圆酵母素和红酵母红素含量比YAD分别增长了187%和185%。由此可知,当crt I与crt YB的比值越大时,色素合成向红色支路进行,能合成更多的圆酵母素和红酵母红素。(3)对掷孢酵母NGR的CrtYB蛋白序列进行生物信息学分析,经BLAST比对发现在其氨基端含有六个跨膜疏水区域,预测有两个CrtY疏水结构域;在羧基端亲水区域,仅预测到CrtB亲水结构域。(4)PCR扩增获得含有Bam HI酶切位点的crt YB-145-597及crt YB-286-597截短片段;将胶回收产物crt YB-145-597和crt YB-286-597连接到克隆载体p MD18T上,成功构建重组质粒p MD18T-crt YB-145-597和p MD18T-crt YB-286-597,并转化至大肠杆菌DH5α,进行crt YB-145-597及crt YB-286-597截短片段扩增。并进一步将其连接至蛋白表达载体pET30a。