研究意义由于创伤、感染、肿瘤、外科手术和各种先天性骨骼畸形导致的软骨缺损修复问题一直以来是困扰临床医师的难题。关节软骨缺损是临床常见疾病,由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流,加之细胞成分单一,其自身修复能力非常有限。在软骨发生缺损后,病人出现关节疼痛以及运动障碍,最终导致骨性关节炎,造成恶性循环,严重影响患者的生活质量。近年来,对软骨缺损修复方法的研究有了飞跃的发展。软骨修复材料的日渐丰富,以“生物治疗”为理念的新型修复方法,为软骨缺损修复提供了众多理论基础和实验依据。生物材料、种子细胞、生物活性的因子的不同组合在软骨缺损的修复中展现了不同的修复能力,尚存在争议。因此,不断加深对软骨生物材料的实验研究,从而构建新型的软骨修复生物材料,观察其在生物体内的软骨修复效果,是当前骨科学研究是重点。不仅可以加深软骨组织工程的研究深度,实践新技术,也可为临床软骨缺损的治疗提供治疗新思路和新方法。研究目的本研究所使用的原代软骨细胞来源于新西兰白兔膝关节,无菌分离后进行体外培养扩增,并用复合不同浓度的抗坏血酸培养液进行原代培养,观察与评估抗坏血酸对新西兰白兔软骨细胞的增值和成软骨分化的影响。此外,PCL生物材料搭载AA活性因子构建生物功能化复合材料修复新西兰白兔膝关节单纯软骨缺损,观察聚已内酯/抗坏血酸复合材料在软骨缺损再生修复应用的效果,为软骨组织工程的基础研究提供实验资料和科学依据。研究方法1.抗坏血酸在新西兰白兔软骨细胞中的促增殖和成软骨分化效果分析动物使用6周龄新西兰白兔,经耳缘静脉空气栓塞猝死,无菌分离膝关节上皮组织,暴露膝关节,无菌刀片削取关节软骨,用二步酶消化法分离获取原代软骨细胞,与25cm2培养瓶中分别培养1、4、7、14天,每瓶种植细胞数为2.5*105个实验组采用复合抗坏血酸培养液培养(浓度为20ug/mL、50ug/mL100ug/mL),对照组则采用普通培养基,即不添加抗坏血酸,其余相同。甲苯胺蓝法检测细胞外基质进行细胞鉴定。根据实验计划不同时间段观察细胞形态、生长密度。羟脯氨酸试剂盒消化法检测细胞分泌的羟脯氨酸含量检测。通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定其聚集蛋白聚糖(Aggrecan),一型胶原(COL1),二型骨胶原(COL2)等软骨相关基因的表达结果。分析不同组的成软骨分化效果。2.PCL/抗坏血酸复合材料用于修复新西兰白兔单纯软骨缺损的实验研究材料使用复合了抗坏血酸(Ascobic Acid,AA)的聚已内酯(polycaprolactone,PCL)材料,每组材料搭载相同的抗坏血酸浓度,另设置单纯材料组、空白组各一组,共3组。A组:PCL+AA;B组:单纯PCL材料;C组:单纯手术空白对照,其中A、B两组填充材料后加入制备好的纤维蛋白胶(fibringel 10μg)和凝血酶原(thrombinogen 10 μg)混合物以固定材料。将8只雄性6月龄新西兰白兔完全随机分成3组,每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径3.5mm、深3mm的单纯软骨缺损模型,不钻通骨髓腔。于术后6周和12周,取材,进行大体观察、HE染色、番红固绿染色、Wakitani修复效果评分以及相关定量分析。研究结果在倒置相差显微镜下观察,体外原代培养新西兰白兔软骨细胞生长旺盛,细胞体积较小,呈多角形,4d培养后,呈梭形并有少量突起,细胞核较大,细胞排列紧密,14d后呈典型“铺石路”样形态。根据取材部位、细胞形态、甲苯胺蓝染色阳性,证明细胞分泌软骨和合成蛋白聚糖,可以间接鉴定培养细胞为软骨细胞。在1/4/7/14天各时间点对AA组和对照组细胞分泌的HYP进行测定,结果显示随着培养时间的延长,AA组HYP分泌量明显大于对照组,差异具有统计学意义。其中AA50组在各时间点分泌量都大于其他各组。RT-PCR结果提示各检测基因在不同时间点达到峰值,成骨基因Col 1在培养初期表达较高,随后减弱,并且AA组各个时间点的表达都低于单纯培养液组。成软骨分化基因Col 2在7d时表达峰值,都高于对照组,其中AA50组中与单纯培养液组有统计学差异(P<0.05)Aggrecan4d时达峰值,随后一直保持较高表达量,AA组表达均高于单纯培养液组。动物手术过程无动物出现麻醉死亡,术后无动物出现感染。对取材组织分析显示:6周标本外观上PCL+AA组修复效果明显优于单纯材料组,空白组组未见软骨缺损修复,边界清楚,中央凹陷明显。PCL+AA组缺损被白色半透明坚硬组织修复,富有光泽。Wakitani评分PCL+AA组优于单纯材料、空白缺损两组(P<0.05)。12周PCL+AA组番红固绿染色显示软骨修复情况优于6周PCL+AA组标本。HE染色各组均未见急慢性炎症细胞浸润。新生软骨面积百分数和新生软骨细胞数定量分析提示PCL+AA组均明显大于单纯PCL材料组(P<0.05),C组未见明显软骨长出。12周PCL+AA组标本评分结果与6周无统计学差异(P>0.05)结论抗坏血酸因子对软骨细胞分泌HYP(胶原合成)有促进作用,并且能促进软骨细胞成软骨分化。复合AA的PCL生物材料具有良好的生物相容性,软骨缺损修复效果优于单纯材料植入,可以有效修复兔关节软骨损伤,可能成为关节软骨损伤治疗新的治疗方法。