研究背景辨证论治作为中医学的精髓,其在几千年的临床实践中不断发展和验效,充分体现了传统医学整体观和个体化的治疗理念,是中医学极具优势的部分。而“证”是辨证论治的依据,是疾病处于一定阶段病因、病位、病性和病势的综合,能体现患者的整体性特征,是中医学现代化研究的核心内容。因此,证本质的研究对于中医理论与临床实践的发展和中医现代化具有极其重要的意义。肝郁证是指由于肝的疏泄功能异常、疏泄不及而致气机郁滞所表现的证候,为病广泛,常见于临床多种疾病中,是中医脏腑证候中常见的证候之一,也是中医肝病发病学的主要环节。研究肝郁证的实质,不仅是中医证本质研究的重要内容,更能为临床多种疾病的诊断和防治提供新的思路和方法。通过肝郁证这一典型证候的研究,探索证本质研究的合适方法,对阐释中医学的科学内涵有实际意义。经过众多学者多年的研究和探索,已初步证实肝郁证具有现代病理生理学基础,并部分地阐释了其中医理论的科学性,取得了阶段性成果：认为和应激密切相关,并且涉及机体神经、内分泌、循环、消化、免疫等多个系统。国外对应激所涉及的下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(HPA)、蓝斑-交感-肾上腺髓质系统(LC-NE)等均研究较为全面。而在国内,虽然与神经内分泌系统关系的研究是近几年来肝郁证研究的热点,但是多集中在HPA轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPTA)或是下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)上,对LC-NE的研究尚未见报道。因此,本课题以LC-NE轴为切入点,希望能为进一步揭示肝郁证的本质和中医基础理论的实验研究作出一份贡献。研究目的采用慢性束缚应激的方法复制大鼠肝郁证模型,观察肝郁模型大鼠在体重、行为学、血清学以及蓝斑、肾上腺髓质中TH和c-fos蛋白及基因表达的变化,尝试从LC-NE轴的角度对肝郁证的微观辨证进行初步探讨；比较逍遥散干预大鼠与模型大鼠之间的差异表达,一方面探讨逍遥散对肝郁证的作用机理,另一方面以方测证、方证互参,说明肝郁证的本质。研究方法1.慢性束缚肝郁大鼠模型的建立动物分组：实验用清洁级雄性SD大鼠36只,鼠龄5周,体重(150±20)g,适应性饲养1周后随机分为正常对照组(A组)、肝郁证逍遥散组(B组)、肝郁证模型组(C组),每组各12只。A组3只1笼,其余2组单笼孤养。模型建立：参照文献,模拟中医情志抑郁的病因,将B、C组大鼠置于特制的束缚制动筒内,固定其身体与尾部,使之不能随意活动。每日开始时间随机,每日束缚制动1次,持续时间从第1天的1h逐渐增至每天6h,连续21d。B、C组大鼠在束缚制动期间禁食、禁水。A组大鼠不予任何干预。药物干预：B组大鼠根据正常成人逍遥散每日用量,按体表面积换算成大鼠用药量为10g/kg.d,根据大鼠个体体重每日下午16时给B组大鼠经胃灌相应药量,A、C组大鼠同时以生理盐水灌胃。从液体消耗、行为学、实验室检查血清NE、逍遥散干预后疗效观察等方面评价模型的可靠性。2.运用HE染色方法,观察大鼠LC、肾上腺髓质的形态学改变。3.用免疫组化法检测LC、肾上腺髓质中TH和c-fos的表达变化。用Imageproplus6.0软件进行分析。4.运用RT-PCR技术检测TH、c-fos的mRNA在LC、肾上腺髓质中的表达变化。5.所有数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。研究结果1.从一般状况来看,C组大鼠开始表现为易激惹、挣扎,随后表现表现为倦怠少动、喜欢贴壁、叫声尖细、反应迟缓、饮食减少,伴有毛色黯淡易于脱落、大便颗粒松散等肝郁证的表现。B组大鼠上述反应较轻,而A组未见异常行为状态。各组间体重增长存在显著差异(P=0.000),C组生长较为缓慢,B组服药后体重增长缓慢的情况得到改善。液体消耗实验提示各组间糖水偏好存在显著性差异(P=0.000),C组的糖水偏好率明显小于其它两组。旷场实验发现C组的直立次数、理毛次数和穿越格数均显著低于A组(P<0.01)。血清NE发现：C组的血清NE浓度明显高于A组(P<0.01)。说明慢性束缚应激确能造成大鼠的肝郁证,能有效的模拟临床中肝郁证兴趣丧失、快感缺乏等症状。2.由HE染色显示,B、C组大鼠LC、肾上腺髓质无明显的形态学改变。3.免疫组化法检测LC、肾上腺髓质中TH和c-fos的表达变化,发现C组TH和c-fos的阳性神经元数目均大于A组(P<0.05),染色强度也明显增强,平均光密度值也明显高于A组(P<0.05)。经逍遥散干预的B组有下调二者表达的作用。4.运用RT-PCR技术检测TH、c-fos的(?)mRNA在LC、肾上腺髓质中的表达,发现与A组比较,C组THmRNA、c-fosmRNA的表达显著增高(P<0.05),B组THmRNA、c-fosmRNA表达较C组明显降低(P<0.05)。TH和c-fos的表达变化是相关的,两者的表达趋势具有相似性。结论本次研究采用慢性应激束缚的方法,成功的复制了大鼠的肝郁证模型。证实在肝郁过程中,LC和肾上腺髓质TH均表达增强,提示LC和肾上腺髓质在应激状况下会释放大量儿茶酚胺,作用于相应受体或靶器官,参与对神经内分泌系统和代谢功能的调节,以适应机体应激产生的反应。c-fos在LC和肾上腺髓质阳性细胞数量和平均光密度均比对照组增加,表达趋势与TH一致,并在同一细胞能够共表达,而且TH启动子上具有c-fos的作用位点,表明c-fos在慢性束缚应激过程中参与了LC和肾上腺髓质TH的表达调控。首次从蓝斑-交感-肾上腺髓质系统对肝郁证进行研究,为进一步研究肝郁证的分子机制提供了理论基础,也为探讨肝郁证实质研究的深入作了有益的尝试。