研究背景:目前,肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,和其他肿瘤一样,肺癌的发生与进展是一个多种因素参与的、多步骤的过程,尤其早期临床症状不明显,容易被忽视,其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年快速上升的趋势。肺癌从病理类型上分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中80%的肺癌为NSCLC。NSCLC中约50%会发生脑转移(Brian metastasis,BM)。发生脑转移后患者生存率较低,自然生存期仅为1-2月。因此,提高进展期非小细胞肺癌的疗效需要提高对转移性疾病尤其是脑转移的认识。当前关于NSCLC发生、发展及脑转移方面的研究不够深入,临床诊疗手段相对落后,患者的预后较差。因此必须寻找新的分子标记物,为NSCLC脑转移患者的早期诊断和治疗提供有效靶点,才能改善患者的预后。Micro RNAs(mi RNAs)是非编码内源RNAs,在转录后水平调控基因表达。Mi RNAs在组织和体液中的稳定性使它们成为预测疗效和判断预后的候选标志物。多个研究发现mi RNAs可作为肿瘤标志物用于患者分层或确定脑转移。既往研究发现micro RNA-375(mi R-375)在脑转移灶中差异表达,揭示mi R-375可能与脑转移相关。大量研究表明,mi R-375表达失调与多种肿瘤发生发展及预后密切相关,在肿瘤增殖、转移侵袭和肿瘤血管生成中起重大作用。目前,关于mi R-375的研究数据主要来源于食管癌、胃癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、结直肠癌。目前,mi R-375在NSCLC中研究较少,在NSCLC脑转移中的研究尚未见报道。本研究通过组织中检测mi R-375在NSCLC脑转移患者中的表达,并与未发生脑转移的NSCLC患者对照,明确mi R-375在脑转移中的作用,为NSCLC脑转移提供早期诊断的分子标记物;通过生存及预后研究,明确mi R-375在NSCLC患者尤其是NSCLC脑转移患者中的预后重要性。通过构建mi R-375慢病毒载体并转染至非小细胞肺癌细胞中,形成稳定克隆,探讨mi R-375对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响,并探讨mi R-375在NSCLC发生发展及发生脑转移中的可能机制,为以后开展动物实验提供较明确的研究方向,未来可能为NSCLC脑转移的治疗提供靶点。目的:(1)检测mi RNA-375在非小细胞肺癌脑转移和非小细胞肺癌未发生脑转移患者组织中的表达差异,明确mi RNA-375在非小细胞肺癌发生脑转移中的作用,并分析mi RNA-375在NSCLC患者和NSCLC脑转移患者预后中的作用。(2)通过构建mi R-375和anti-mi R-375的病毒质粒,转染至非小细胞肺癌细胞系中,研究mi R-375对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响。(3)通过检测mi R-375下游蛋白的表达,探索mi R-375在非小细胞肺癌及发生脑转移中的可能机制。方法:(1)Mi R-375作用研究收集30例非小细胞肺癌脑转移患者肿瘤组织标本(包括原发肺癌组织和脑转移瘤组织)及癌旁组织标本,通过实时荧光定量逆转录PCR方法(quatitive Real-time PCR,q RT-PCR)检测mi R-375在非小细胞肺癌脑转移患者肺部原发灶、脑转移灶、癌旁组织中的表达情况;收集30例非小细胞肺癌未发生脑转移患者的肺癌原发灶、癌旁组织标本,q RT-PCR检测mi R-375的表达。以上根据组织来源可分为四组来研究mi R-375的表达水平,即NSCLC脑转移患者脑部转移灶、NSCLC脑转移患者肺部癌组织、NSCLC未发生脑转移患者肺部癌组织及癌旁组织组。通过t-检验比较mi R-375在NSCLC脑转移和NSCLC未发生脑转移患者中表达水平的统计学差异。(2)统计方法研究生存、预后及NSCLC脑转移相关分子的探索通过方差分析研究mi R-375的表达与患者临床病理特征(分期、淋巴结转移、脑转移)的关系。Log-rank检验和Kaplan-Meier生存曲线比较总生存时间与mi R-375表达的关系。应用多因素COX回归模型明确NSCLC患者和NSCLC脑转移患者预后影响因素。PCR法检测EGFR、K-ras突变,免疫组化SP法检测VEGF、MMP-9的表达,应用卡方检验明确EGFR突变、K-ras突变、VEGF表达、MMP-9表达与脑转移的关系,并应用t-检验分析EGFR突变、K-ras突变、VEGF表达、MMP-9表达与mi R-375表达的关系。(3)通过Eco RI和Bam HI酶切及连接后产生携带mi R-375-EGFP、anti-mi R-375-EGFP和EGFP三个质粒,用HIV包被及转染HEK-293T细胞,后侵染非小细胞肺癌A549细胞,筛选出3个抗性克隆A549-mi R375-GFP、A549-anti-mi R375-GFP、A549-GFP,并用A549作为空白对照。通过培养和筛选形成,形成4组稳定的细胞系。MTT法测定细胞增殖,通过Transwell侵袭和迁移实验、划痕试验研究mi R-375对非小细胞肺癌细胞生物学特征的影响。(4)应用体外成管实验明确mi R-375的作用机制,Western blot法检测下游VEGF、MMP-2、MMP-9、EGFR的表达,探索mi R-375在非小细胞及脑转移发生发展中的可能机制。结果:(1)Mi R-375在非小细胞肺癌脑转移灶、非小细胞肺癌脑转移患者肺部原发癌组织、非小细胞未发生脑转移患者原发肺癌组织、癌旁组织表达量分别为:0.28±0.05,0.47±0.06,0.71±0.13,1.00±0.17。每两组之间的差别均有统计学意义(P<0.05)。与NSCLC未发生脑转移的患者相比,NSCLC脑转移患者mi R-375的表达水平呈明显下调,并且同一NSCLC脑转移患者mi R-375在脑转移灶中的表达低于肺部原发癌组织,且二者差别有统计学意义(P<0.05);NSCLC未发生脑转移患者原发肺癌组织中mi R-375的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01)。(2)Mi R-375的低表达与NSCLC患者的分期晚和脑转移灶数目增多相关。对于该研究60例NSCLC患者来说,mi R-375低表达组OS明显短于高表达组,且二者差别具有统计学意义(log-rank test P<0.01);同样,对于NSCLC脑转移患者来说,mi R-375低表达组生存时间明显短于高表达组(log-rank test P<0.05)。Mi R-375的表达是NSCLC患者独立的预后因子。与NSCLC脑转移相关的分子为VEGF和MMP-9的表达,而EGFR和K-ras突变与脑转移无明显相关;VEGF和MMP-9在mi R-375低表达的患者中呈明显过表达,而EGFR和K-ras突变与mi R-375的表达水平无关。(3)通过稳定转染,筛选并培养成功以下四个A549细胞系:A549-mi R-375-GFP、A549-anti-mi R-375-GFP、A549-GFP和A549。MTT增殖实验:A549-mi R-375-GFP组细胞的增殖率较A549-GFP(Control)组和A549空白对照组明显降低,且差别具有统计学意义(P<0.05)。而A549-anti-mi R-375-GFP组较空白对照组和Control组增殖率明显升高(P<0.01)。空白对照组和阴性对照组(Control组)二者无明显差别(P>0.05)。而观察72小时荧光显微镜下细胞增殖最快的为A549-anti-mi R-375-GFP组,最慢的为A549-mi R-375-GFP组。(4)Transwell侵袭实验结果显示,A549细胞能侵袭穿越基质胶。A549-mi R-375-GFP组穿膜细胞数较少,为75.12±6.21,明显低于空白组(125±10.27)和Control组(129.51±8.28)(P<0.05);A549-anti-mi R-375-GFP组穿膜细胞数最多,为199.67±9.23,明显高于空白组和Control组(P<0.05)。空白组和Control组差别无统计学意义(P>0.05)。(5)Transwell迁移实验结果显示,A549-mi R-375-GFP组穿膜细胞数较少,为50.33±9.32,低于空白组(108±9.38)和Control组(110±7.82)(P<0.05);A549-anti-mi R-375-GFP组穿膜细胞数最多,为178±10.89,明显高于空白组和Control组(P<0.05)。空白组和Control组差别无统计学意义(P>0.05)。(6)划痕实验:A549-mi R-375-GFP组、A549-anti-mi R375-GFP、A549-GFP三组分别用100?l无菌枪头垂直划痕,记为0小时,24小时候观察划痕区发现A549-anti-mi R375-GFP划痕区最小,细胞几乎全部侵入;而A549-mi R-375-GFP组划痕区最大,细胞迁入明显最慢,而A549-GFP组划痕区范围居以上二者中间。(7)体外成管实验:细胞系放入细胞培养箱中,观察成管,1周后发现3D成像,A549--mi R375-GFP和A549-GFP组3D成像未发现成管现象,而A549-anti-mi R375-GFP 3D成像成管较多。(8)Western Blot检测EGFR、VEGF、MMP-2、MMP-9的表达:VEGF、MMP-2、MMP-9在PC14/B中呈明显高表达,而在PC14中呈低表达。A549细胞系中,A549-mi R-375-GFP组VEGF、MMP-2、MMP-9呈低表达,而在A549-anti-mi R375-GFP组中VEGF、MMP-2、MMP-9呈明显过表达,另外A549-GFP组和A549组VEGF、MMP-9无明显差别,而MMP-2在A549-GFP组中表达较A549高。EGFR在PC14和PC14/B中无明显差异,并且在A549细胞各组之间表达无明显差别。结论:1.本研究表明mi R-375与NSCLC脑转移明显相关,mi R-375的下调可作为预测NSCLC脑转移的因子,可用于筛查出脑转移高危人群。Mi R-375有望在早期诊断中发挥作用。2.Mi R-375的表达与分期晚和脑转移明显相关;Mi R-375在NSCLC和NSCLC脑转移患者中表达水平越低,生存时间越短,并且mi R-375的表达水平是NSCLC患者的独立预后因子。3.Mi R-375的下调可促进非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及血管生成,mi R-375可能通过血管生成途径与非小细胞肺癌增殖、侵袭甚至脑转移相关。Mi R-375将来可能为非小细胞肺癌脑转移的治疗提供了新的靶点或新的治疗药物。4.EGFR突变和K-ras突变与非小细胞肺癌脑转移无明显相关。