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米多霉素是一类肽核苷类抗生素,具有强烈的抑制植物白粉病的活性。本研究利用来自杀稻瘟菌素生物合成基因簇上的胞嘧啶核苷单磷酸水解酶基因blsM及其同源基因设计兼并引物,从生裂链轮丝菌ZJU5119的基因组文库中筛选出六个相互重叠的柯斯质粒,其中柯斯质粒14A6可以使异源宿主变铅青链霉菌合成米多霉素,表明其包含了米多霉素生物合成所必须的全部基因。对14A6进行序列测定,其插入序列全长43,561bp,通过FramePlot beta4.0预测,它包含41个开放阅读框。其中milA编码了胞嘧啶核苷单磷酸羟甲基化酶,敲除milA的生裂链轮丝菌突变株只产生去羟甲基米多霉素。MilB是BlsM的同源蛋白,milB的突变株丧失了产生米多霉素和去羟甲基米多霉素的能力。大肠杆菌融合表达的MilA蛋白能够专一的在胞嘧啶核苷单磷酸的C5位上引入羟甲基基团,而不接受胞嘧啶或胞嘧啶脱氧核苷单磷酸作为其底物;融合表达的MilB的酶动力学实验表明:它能够高效的水解羟甲基胞嘧啶核苷单磷酸成羟甲基胞嘧啶,同时也能够水解胞嘧啶核苷单磷酸形成胞嘧啶;在MilA和MilB共同作用下形成的羟甲基胞嘧啶和胞嘧啶的比例约为9:1,而生裂链轮丝的发酵产物中米多霉素的产量与去羟甲基米多霉素比例却只有3:1,这种不一致在UDP-葡萄糖醛酸转移酶MilC的动力学反应参数中得到了解释,MilC催化UDP-葡萄糖醛酸与胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶反应的Kcat/Km分别为: 0.5250±0.0019和0.2719±0.0012,表明其对胞嘧啶有着更高的催化效率,这部分抵消了MilB对羟甲基胞嘧啶强烈的偏好性。米多霉素生物合成中一个让人迷惑而又引人兴趣的问题是葡萄糖残基C6原子的来源。用稳定性同位素C13 6个碳原子全标记的精氨酸喂养生裂链轮丝菌,其发酵产物中发现了分子量为520的米多霉素,含量比本底水平增高5倍,而非标记的米多霉素分子量为514。同时,高分辨二级质谱数据中所有包含胍基侧链的断裂碎片都比未喂养的对应部分分子量增高了6,表明标记的6个碳原子在精氨酸或者其衍生物与葡萄糖醛酸缩合过程中全部保留了下来,脱羧反应去掉的是葡萄糖醛酸羧基碳。所以,米多霉素葡萄糖残基C6原子来源于精氨酸而不是葡萄糖。为了系统的提出米多霉素完整的生物合成途径,我们结合异源表达和系统突变,首先确定了米多霉素生物合成基因簇的左右两个边界分别位于orf-1-milA与milQ-orf+1之间,对其中包括的17个orf一一进行突变,除了milL突变没有影响之外,证明其它的16个基因与米多霉素的生物合成相关。milG编码的是一个新颖的Radical SAM家族蛋白,它是唯一一个氧化还原酶候选基因,负责羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸C4位上羟基氧化成羰基,在milG突变株的发酵液中,中间产物羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸大量积累,这充分证明了其功能就是负责这一步关键的催化反应,这也是第一次在核苷类抗生素生物合成中报道的新型氧化酶基因。分别敲除两个氨基糖苷类磷酸转移酶基因milE和milQ,突变株都丧失了产生米多霉素的能力,推测这两个磷酸转移酶可能负责糖上的C2-C3间双键的形成。可能编码天冬氨酸/酪氨酸/芳香族氨基酸类氨基转移酶的milM和编码二氢吡啶甲酸合酶的milN基因的突变株均不能够再产生米多霉素,MilM可能参与催化精氨酸α位的氨基转化成羰基而形成α-酮酸,而MilN则负责α-羰基与脱羧后的己糖碳负离子之间的缩合。编码degT/dnrJ/eryC1/strS类氨基转移酶的milD和编码可能的连接酶功能的milH突变株都丧失了产生米多霉素的能力,推测前者是负责C4位上羰基的转氨反应,后者负责将激活的丝氨酸连接到C4位的氨基上,形成类似肽键的酰胺键。而中断LuxR家族的转录调节因子基因milO也消除了米多霉素的生产,说明它可能是一个途径专一性的调节基因。MilJ显示与Ubiquitone的羟甲基化酶有一定的同源性,可能负责精氨酸的gamma羟化;而MilI可能负责了丝氨酸的活化;ABC transporter基因milP的突变株也不产米多霉素,它很可能是米多霉素的抗性基因;编码Major Facilitator Superfamily的基因milk的突变株还能够产生米多霉素,但产量降低,它可能与磷酸葡萄糖的转运有关。