论文部分内容阅读
目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，因其发病率、死亡率高，严重危害女性健康。乳腺癌作为一种异质性疾病，其中三阴乳腺癌（triple-negativebreast cancer，TNBC）是指雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)均阴性的乳腺癌，是近年来研究最广泛的一种类型，约占所有乳腺癌的20%，多见于年轻女性患者，肿瘤恶性程度高，易出现局部或远处淋巴结转移，预后最差。随着分子生物学时代的到来，TNBC同样作为一种异质性群体存在，根据基因表达谱的分析，其中一小部分TNBC属于乳腺癌分子分型中的正常乳腺样型，此型乳腺癌EGFR表达阴性且预后良好，而其余80%的TNBC属于基底细胞样型（即Basal-like型），此型EGFR表达阳性且预后最差。如何对TNBC实施有效的治疗，已成为乳腺癌治疗的重点和难点。针对这一严峻形势，进一步探索TNBC发病机制，寻找有效的乳腺癌治疗方法势在必行。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，包括四大成员：ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4，是与乳腺癌关系最为密切的一类生长因子受体。表皮生长因子受体通过与配体（如EGF）结合形成同源或异源二聚体，进一步激活多条信号转导通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt等，发挥促进肿瘤增殖、侵袭、转移及血管生成作用。其中EGFR是此家族中最重要的成员。研究报道，EGFR是一种与乳腺癌进展和预后不良相关的标志性分子。35%-50%的乳腺癌中EGFR呈高表达，特别是三阴乳腺癌患者普遍伴有EGFR过表达。因此，在EGFR过表达的TNBC中，EGFR将成为一个很有吸引力的治疗靶点。目前针对EGFR的分子靶向药物如西妥昔单抗等已应用于乳腺癌的临床治疗，但其单独应用有效率不高且伴有耐药问题，提示在EGFR过表达的乳腺癌中可能还有其它的分子影响EGFR信号通路活化，在乳腺癌的发病中发挥重要作用。细丝蛋白A（Filamin A，FLNa）又称ABP-280，是一种肌动蛋白结合蛋白。在细胞浆内广泛分布，也可跨膜或于细胞核内存在。FLNa是“V”形的同型二聚体，由肌动蛋白结合区、24个重复β-折叠片层结构以及两个绞链区组成。FLNa的特殊结构决定其具有强大的功能：其分子可交联肌动蛋白丝形成稳定的细胞骨架，并与多种细胞膜蛋白结合，影响如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多条信号转导通路，进而影响肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭等行为。Zhu等认为FLNa可以调控人黑色素瘤细胞EGFR的活化，而FLNa是否也影响TNBC细胞EGFR的活化目前尚无报道。本研究拟通过：（1）采用质粒转染技术，建立沉默FLNa的三阴乳腺癌MDA-MB-436稳定细胞株；（2）采用MTT比色分析法、划痕修复实验、Transwell法以及明胶酶谱法检测稳定转染细胞株的增殖、迁移和侵袭能力；（3）采用Western blot法，检测EGFR及其下游信号通路中各激酶的活化水平。旨在从细胞、分子水平分析FLNa对TNBC细胞MDA-MB-436增殖、迁移和侵袭的影响，探讨FLNa调控EGFR活化及其下游信号分子的作用机制，为更有效治疗TNBC提供新靶点。方法：1质粒转染技术建立沉默FLNa的稳定细胞株将FLNa shRNA质粒转染人TNBC细胞MDA-MB-436，经嘌呤霉素抗性筛选，得到沉默FLNa的稳定细胞株（MDA-MB-436/KD）及其对照组细胞（MDA-MB-436/Ctrl）；利用实时定量PCR（RT-PCR）和Western blot检测稳定细胞株中FLNa mRNA和FLNa蛋白的水平。2MTT比色分析法检测稳定转染细胞株的增殖能力将MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl细胞分别接种于96孔板，经不同浓度EGF（0nM、4nM、20nM、100nM）刺激培养48h后，加入MTT，测定各孔吸光度（OD）值，检测稳定转染细胞株的增殖能力。3划痕修复实验检测稳定转染细胞株的迁移能力将MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl细胞分别接种于24孔板，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4h，用10μl移液器吸头划痕，两种细胞分别分为无EGF刺激组和20nM EGF刺激组；在倒置显微镜下观察并拍照，直至划痕愈合。4Transwell法检测稳定转染细胞株的侵袭能力将基质胶铺于Transwell小室的上室，将MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl两组细胞分别接种于上室，在无胎牛血清的1640培养液中培养，下室放入含10%胎牛血清的1640培养液，培养24h后；取出小室，并且用95%冰乙醇固定、HE染色，显微镜下拍照并计数穿膜细胞数。5明胶酶谱法检测稳定转染细胞株的侵袭能力将MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl细胞分别接种于35mm培养皿，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4h，两种细胞分别分为无EGF刺激组和20nM EGF刺激组，培养16h后收集上清；采用明胶酶谱法测定上清中MMP-9蛋白的活性。6Western blot检测EGFR活化水平及其下游信号通路分子的变化将MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl细胞分别接种于35mm培养皿，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4h，经20nM EGF刺激后。于不同时间（0min、5min、10min、30min）收集细胞，提取总蛋白；采用Western blot检测FLNa、p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平。结果：1稳定转染细胞中FLNa的水平检测1.1稳定转染细胞FLNa mRNA的水平采用RT-PCR检测稳定转染细胞FLNa mRNA的水平，结果显示，MDA-MB-436/KD细胞FLNa mRNA的相对定量值（0.23±0.01）明显低于MDA-MB-436/Ctrl细胞（1.00±0.00），有统计学意义（P<0.01）。1.2稳定转染细胞FLNa蛋白的水平采用Western blot检测稳定转染细胞FLNa蛋白的水平，结果显示，MDA-MB-436/KD细胞FLNa的相对表达量（0.33±0.09）明显低于MDA-MB-436/Ctrl细胞（1.20±0.04），有统计学意义（P<0.01）。2稳定转染细胞增殖、迁移和侵袭情况2.1稳定转染细胞的增殖情况采用MTT法检测稳定转染细胞的增殖能力，结果显示：不同浓度EGF（0nM、4nM、20nM、100nM）刺激的MDA-MB-436/KD组细胞的OD值(1.26±0.03，1.39±0.01，1.55±0.02，1.82±0.04)明显高于MDA-MB-436/Ctrl组(0.88±0.02，0.98±0.03，1.07±0.14，1.38±0.09)，均有统计学意义（P<0.01）。2.2稳定转染细胞的迁移情况利用划痕修复实验检测稳定转染细胞的迁移能力，结果显示：无EGF刺激时，MDA-MB-436/KD组各时间点的迁移率（23.06±0.14%，23.26±0.14%，39.62±0.04%，47.16±0.16%）均明显高于MDA-MB-436/Ctrl组（7.85±1.08%，7.85±1.87%，12.15±0.53%，20.93±1.39%），均具有统计学意义（P<0.01）；给予20nM EGF刺激时，MDA-MB-436/KD组各时间点的迁移率（30.16±0.62%，36.59±0.77%，42.87±1.53%，50.00±0.00%）同样均明显高于MDA-MB-436/Ctrl组（13.34±0.51%，14.38±1.18%，15.80±1.56%，25.65±0.43%），均有统计学意义（P<0.01）。2.3稳定转染细胞的侵袭情况2.3.1采用Transwell法检测稳定转染细胞的侵袭能力，结果显示：MDA-MB-436/KD组穿膜细胞数(154±5)明显高于MDA-MB-436/Ctrl组（70±4），有统计学意义（P<0.01）。2.3.2采用明胶酶谱法检测稳定转染细胞MMP-9蛋白的活性，结果显示：无EGF刺激时，MDA-MB-436/KD组MMP-9蛋白的活性（1.00±0.00）明显高于MDA-MB-436/Ctrl组（0.10±0.03)，具有统计学意义（P<0.01）；给予20nM EGF刺激时，MDA-MB-436/KD组MMP-9蛋白的活性（2.30±0.17）同样明显高于MDA-MB-436/Ctrl组（0.24±0.02），具有统计学意义（P<0.01）；3稳定转染细胞EGFR活化水平及其下游信号通路分子的变化利用Western blot检测EGF刺激0min、5min、10min、30min后稳定转染细胞中各蛋白的水平，结果显示：MDA-MB-436/KD组各时间点FLNa的表达量（0.22±0.02，0.25±0.03，0.22±0.02，0.23±0.04）均明显低于MDA-MB-436/Ctrl组（0.82±0.03，0.83±0.03，0.82±0.03，0.84±0.03），均有统计学意义（P<0.01）；经EGF刺激5min、10min、30min后p-EGFR的水平（0.83±0.02，0.71±0.05，0.59±0.03）均明显高于对照组（0.42±0.05，0.17±0.01，0.07±0.03），均有统计学意义（P<0.01）；p-Akt的水平（0.84±0.05，0.63±0.04，0.46±0.03）均明显高于对照组（0.44±0.03，0.24±0.03，0.06±0.02），均有统计学意义（P<0.01）；p-ERK的水平（0.83±0.02，0.86±0.02，0.79±0.02）均明显高于对照组（0.44±0.04，0.27±0.04，0.17±0.03），均有统计学意义（P<0.01）。结论：1降低FLNa的表达水平可促进三阴乳腺癌MDA-MB-436细胞的增殖、迁移和侵袭。2FLNa通过调控三阴乳腺癌MDA-MB-436细胞EGFR的活化（磷酸化）水平，影响MAPK/ERK及PI3K/Akt信号转导通路激酶的活化，进而影响MDA-MB-436细胞的生物学行为。