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CD13是一种锌离子依赖的蛋白酶。CD13分布于多种组织细胞表面,具有水解中性氨基酸、参与信号传导与免疫调节、促进肿瘤迁移的作用,也可以作为一些病原微生物的黏附结合受体,近年来被广泛关注和研究。IPEC-J2和IPI-2I是两种被广泛用来研究与病原微生物相互作用的猪肠道上皮细胞系。本研究采用CRISPR/Cas9系统,在猪CD13基因第二外显子(编码氨基酸的起始外显子)上起始密码子ATG后设计2个向导RNA(small guide RNA,sg RNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到p X330-GFP和p X330-RFP载体骨架上。将构建好的载体分别转染进DH5α感受态细胞中,涂布含有氨苄的LB平板上进行生长,挑取单菌落进行测序。选择测序正确的菌落进行扩大培养,提取无内毒素质粒为后续试验提供试验材料。利用电转染的方法将p X330-g3-GFP和p X330-g5-RFP同时转染到IPEC-J2细胞中,培养48 h后使用流式细胞术进行红绿双荧光筛选并将部分阳性细胞分离到96孔细胞培养板内,每孔1个细胞进行单克隆细胞培养。对单克隆细胞培养后利用PCR扩增、电泳、测序鉴定,从而获得CD13基因纯合敲除细胞系。利用Western blot检测双等位基因纯合片段敲除细胞CD13蛋白的表达。使用CCK-8检测并绘制细胞生长曲线。划痕愈合试验、Transwell试验被用来检测敲除型细胞迁移能力。结果表明,本试验共获得20株单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行PCR扩增并挑取部分克隆PCR产物进行测序,发现共有7个克隆发生了片段缺失,3个克隆发生双等位基因纯合片段缺失;双等位基因纯合片段敲除细胞的CD13蛋白几乎不表达,表明我们成功构建了CD13基因敲除的IPEC-J2细胞系;CCK-8增殖检测结果表明,敲除型与野生型细胞之间增殖速度差异不显著;划痕愈合试验表明两种细胞迁移速度差异不明显;Transwell结果表明,两种细胞迁移速度差异不显著。利用同样的方法将两种质粒共转染进IPI-2I细胞中,经流式分选、分离培养获得310株单克隆细胞,电泳结果表明48株单克隆发生了片段缺失,32株单克隆发生双等位基因片段缺失;对双等位基因片段缺失的单克隆进行测序后发现有23株为双等位基因纯合敲除型细胞。Western blot检测发现双等位基因纯合片段敲除272 bp细胞几乎不表达CD13蛋白,表明IPI-2I细胞CD13基因被成功敲除;CCK-8增殖检测结果表明,敲除型与野生型细胞相比增殖速度差异不显著;划痕试验表明两种细胞迁移速度差别不明显;Transwell试验结果表明,与野生型细胞相比敲除型IPI-2I细胞的迁移速度差异不显著。本试验制作了两种猪小肠上皮细胞CD13基因敲除的细胞系并对其部分能力进行了检测。为后续研究CD13与病原微生物在猪小肠上皮上的相互作用,及CD13基因的功能研究提供了试验材料。