金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是一种重要的人类和动物病原体细菌,能够引起多种类型的感染性疾病,在临床上主要通过使用抗生素来进行治疗。然而随着耐药性菌株,特别是甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRS A)的全球性传播,抗生素治疗遇到了前所未有的挑战。由于获得了能够编码PBP2a这种替代性青霉素结合蛋白的基因mecA, MRSA菌株对几乎所有类型的p内酰胺类抗生素产生了抗性。基因mecA位于一个可移动的遗传元件SCCmec上,该元件上同时也携带有编码一套整合酶的基因ccrAB或ccrC,它们编码的Ccr整合酶参与了SCCmec的剪切和整合,而且ccrAB或ccrC的表达水平紧密关联着SCCmec元件的稳定性及其平行基因转移。早期的研究发现ccrAB基因只在一小部分的细胞中有表达,而且其所占的比例或者ccrAB基因整体的表达水平可以明显受到温度和抗生素等外界因素的影响,说明在ccrAB基因的表达过程中存在着一套非常精细的调控过程,而关于这一调控机理的研究还是一片空白。本课题主要通过以下两部分的研究对ccrAB表达的调控机制进行阐述,1.辅助性sigma因子在ccrAB转录以及SCCmec剪切过程中的调控辅助性sigma因子在金葡菌中介导了多种环境因子的感应以及细菌细胞生理过程的调控,早期的研究也发现SigH参与了金葡菌中原噬菌体基因组剪切和整合的调控。这些研究结果提示我们辅助性sigma因子也有可能参与调控了SCCmec元件的剪切和整合。在该研究中,我们首先确定了ccrA和ccrB处于同一个操纵子中,而且它们的转录水平表现出了明显的时相依赖性。我们分别在N315菌株中过表达了SigB, SigH, SigS三种辅助性sigma因子,结果显示SigB的过表达明显提高了ccrA基因的转录水平,进一步的研究也发现SigB的过表达能够明显提高SCCmec元件的剪切。通过引物延伸实验和5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)我们鉴定出了一个之前从未被报道的SigB识别序列,而且该序列存在于多种SCCmec Ⅱ型和Ⅳ型的菌株中。2.反向重复序列以及蛋白调控因子SarS在ccrAB转录以及SCCmec剪切过程中的调控在对N315菌株中ccrAB基因启动子区域的序列分析过程中,我们发现了一段反向重复序列,进一步分析发现它广泛存在于不同类型的携带ccrAB基因的SCCmec元件中,而且在碱基组成和相对于ccrA翻译起始位点的位置上都非常保守。碱基替换相关的配对碱基可以明显提高ccrAB基因启动子的活性,而且无论是替换反向重复序列的上游配对部分还是下游配对部分对ccrAB基因启动子活性的影响基本一致,说明该段序列是通过一种特殊的空间结构来影响ccrAB的表达,此外,通过在N315基因组中直接替换该配对碱基或者通过在ccrAB过表达质粒中替换该部分碱基可以明显影响SCCmec元件的稳定性。以上结果说明反向重复序列在ccrAB基因的表达以及SCCmec元件的稳定性方面起到了无可忽视的作用。通过DN A pull-down的方法我们发现了一个可以特异性结合ccrAB启动子的调控蛋白SarS, EMSA的结果显示它可以特异性的同上述反向复复序列结合。实时定量PCR以及启动子同lacZ基因融合报告的结果显示SarS在细菌生长的稳定期对ccrAB基因的表达进行了调控,而且过表达SarS可以明显提高ccrAB基因的转录和增强SCCmec元件的剪切。