充血性心力衰竭是一种发病率高，死亡率高，严重威胁人类健康的复杂临床症候群。近年来，人们做了大量的工作从分子水平和细胞水平研究心肌收缩力下降的机制。氧源自由基（OFR）参与了梗塞后心力衰竭的形成。黄嘌呤氧化酶（XO）是核酸降解中嘌呤氧化的限速酶。在缺血组织中，XO转化为黄嘌呤氧化还原酶（XD）。XO／XD参与体内嘌呤代谢，生成活性氧·O^-、H₂O₂和尿酸。通过黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系介导产生的OFR对梗塞后心力衰竭发生有重要作用。近来有关于黄嘌呤氧化酶抑制剂能够改善心力衰竭心肌的异常兴奋收缩藕联状态，增加肌丝对钙的敏感性，增强心肌收缩力的报道。另外，还有氧化嘌呤酶已用于Ⅲ度充血性心力衰竭的临床治疗的报道。氧化嘌呤酶是一种活化的黄嘌呤氧化酶抑制剂，本文主要观察它对梗塞后心力衰竭心肌兴奋收缩藕联过程中心肌收缩力及细胞内钙含量变化、心肌组织黄嘌呤氧化酶的活性、脂质和蛋白氧化的指标以及心脏功能的影响，探讨抗氧化治疗心肌梗塞后心衰发生的机制，评价氧化嘌呤酶抗氧化剂对心肌梗塞后心力衰竭心肌的保护作用，进而寻求治疗心力衰竭的理想药物。1．实验分组和心力衰竭动物模型制备将35只SV-129小鼠（体重22.0～27.1g克）随机分成三组：对照组（sham组只做开胸手术，但并不结扎动脉）（n=10），梗塞后心力衰竭组（MI组结扎左冠状动脉的前降支，制备大面积心肌梗塞后心力衰竭动物模型）（n=13），氧化嘌呤酶组（MI+oxy组结扎冠状动脉后立即给与氧化嘌呤酶1.0mmol／L加入饮水中）（n=12）。梗塞8周后，用超声评价左心室功能。观察左室半径，室壁厚度，射血分数等指标以及室壁运动情况。称量小鼠肝脏，心脏及左右心室重量作为评价右心功能的指标。2．肌小梁的分离腹腔内注射0.1～0.2mL苯巴比妥钠。迅速开胸剪下心脏，用含有2，3-丁二酮单肟（BDM）的Krebs-Henseleit（K-H）冷停搏液逆行灌注心脏，使其停止跳动。在显微镜下小心分离完整的肌小梁。测量肌肉的长度（2.15±0.17），宽度（0.19±0.015），厚度（0.11±0.01）（mm）。然后将其转移到充满循环K-H灌流液的测量力与钙的特殊装置中，轻轻挂在力传感器上。给予肌肉0.5HZ的电刺激20分钟，使其恢复收缩。灌流速度为10ml／min，灌流温度为20～22℃。K-H灌流液的成分为（mM）：120 NaCl，20 NaHCO₃，1 Na₂HPO₄，1 MgSO₄，5 KCl，0.5 CaCl₂，10葡萄糖。灌注前需用95％O₂与5％CO₂平衡（pH7.4）。3．细胞内钙含量和心肌收缩力的测定方法将荧光指示剂fura-2钾盐用毛细玻璃管拉制的微电极注入肌小梁的2-3个心肌细胞中，注射电流为4～8nA，注射时间为15min／细胞。注射完毕后，刺激肌肉收缩，使fura-2通过心肌细胞的间隙连接均匀地扩散到整块肌肉中（约30min）。然后，通过测定紫外光在340，380 nm处激发细胞内fura-2所产生荧光的强度，根据公式[Ca²⁺]_i=K’_d(R-R_min)／(R_max-R)计算细胞内钙的含量。其中R是实际测得肌肉在340，380 nm处产生荧光的比值，即R=R₃₄₀／R₃₈₀；R_max是在细胞外钙浓度达到饱和状态时肌肉在340，380 nm处产生荧光的比值；R_min是在细胞外钙浓度为0时肌肉在340，380 nm处产生荧光的比值；K’_d为解离常数。本实验中K’_d，R_max，R_min分别为3.3，10.33和0.23，通过校正试验获得。通过力传感器测定肌肉收缩力，所有测得的数据均用该肌肉的横截面积（宽*厚*π／4）校正。力的单位为mN／mm²。4．测定不同细胞外钙浓度时细胞内钙浓度和心肌收缩力分别测定在不同细胞外钙浓度时（0.5—10mmol／L）心肌收缩期与舒张期心肌张力及细胞内钙浓度的变化情况（刺激频率为0.5HZ）。5．测定不同刺激频率时细胞内钙浓度和心肌收缩力分别测定在不同刺激频率时（0.5，1，2，3，4，5HZ）心肌收缩期与舒张期心肌张力及细胞内钙浓度的变化情况（细胞外钙浓度为1.0mMol／L）。6．测定心肌收缩力和细胞内钙浓度达到峰值以及下降50％的时间（ms）7．在ryanodine（1μmol／L作用于肌浆网的RyR2受体）作用下，测定心肌细胞内钙浓度达到饱和状态时心肌的最大收缩力（Fmax）8．黄嘌呤氧化酶活性的测定采用Amplex（?） Red黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶分析试剂盒（Molecular Probe）测定心肌组织中黄嘌呤氧化酶的活性。黄嘌呤氧化酶活性表示为mU／mg蛋白。用BCA蛋白分析试剂盒（Pierce）测定肌丝总蛋白。9．脂质过氧化产物的测定测定心肌组织均浆中，脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的浓度。利用硫代巴比妥酸（TBA）与MDA反应，生成硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）。结果表示为TBARS nmol／mg蛋白。用BCA蛋白分析试剂盒（Pierce）测定肌丝总蛋白。10．OXYblot^TM检测蛋白氧化肌丝蛋白的抽提是采用Canton的方法。采用OXYblot^TM蛋白氧化检测试剂盒观察心肌组织蛋白的氧化—肌动蛋白氧化修饰后蛋白羰基化。统计学方法：采用ANOVA检验。0＜0.05时，表示两组之间有显著差异。p＞0.05时，表示两组之间无显著差异。所有数据均表示为“均值±标准差”。结果：1．评价小鼠的心脏功能梗塞后心力衰竭组室壁运动明显减弱，甚至出现矛盾运动。氧化嘌呤酶能够显著增加室壁运动的幅度，改善左室的射血功能。氧化嘌呤酶显著增加左室短轴缩短率（％）（oxy+MI group：29.55±2.58 vs MI group：19.88±1.73，p＜0.05）和室壁厚度变化率（％）)（oxy+MI group：34.14±3.28 vs MI group：25.88±2.42，p＜0.05）。对照组，梗塞后心衰组和氧化嘌呤酶组EF值（％）分别为（74.5±7.1，54.9±5.1和67.9±5.4）。氧化嘌呤酶使左室射血分数（EF）明显增加（p＜0.05）。氧化嘌呤酶也能显著改善右室功能。与心肌梗塞后心衰组相比较有显著差异（p＜0.05）。2．心肌收缩力与细胞内钙的关系正常情况下（在一定细胞外钙浓度范围内、一定刺激频率范围内），随着细胞外钙浓度的增加（0.5—10mMol／L），心肌细胞收缩期的细胞内钙增加，心肌的收缩力也增加，收缩期心肌的收缩力和细胞内钙成正比。而心力衰竭心肌组织，细胞外钙浓度增加时，细胞收缩期的细胞内钙增幅很小，心肌收缩力较正常组明显下降（p＜0.05）。在细胞外钙浓度为10mmol／L时，对照组，梗塞后心衰组和氧化嘌呤酶组心肌收缩力分别为（70.29±6.72，34.45±3.37和60.22±6.02mN／mm²）细胞内钙([Ca²⁺]_i分别为（1.05±0.10，0.54±0.05和0.82±0.08μmol／L）。梗塞后心衰心肌表现出严重的钙转运障碍。氧化嘌呤酶不但使细胞内钙接近正常水平而且使心肌收缩力得到显著改善。氧化嘌呤酶组心肌的收缩力和细胞内钙浓度与心衰组相比，有显著差异（p＜0.05）。舒张期随着细胞外钙浓度的增加心肌的收缩力和细胞内钙变化不大。氧化嘌呤酶对舒张期心肌收缩力和细胞内钙没有影响。在一定细胞外钙浓度一定时（1mmol／L），正常心肌随着刺激频率增加（生理刺激频率范围内0-5HZ）的增加，心肌细胞收缩期的细胞内钙增加，心肌的收缩力也增加，收缩期心肌的收缩力和细胞内钙成正比。而心力衰竭心肌组织，在较高频率时（3-5HZ），不但细胞内钙不随刺激频率的增加而增加，而且心肌的收缩力明显下降。心力衰竭心肌出现室性心律失常，如室性早搏、二联律、甚至出现室速、室颤。增加刺激频率所诱发的严重的室性心律失常是导致心力衰竭心肌收缩力下降的主要原因。另外，刺激频率增加使心肌细胞内钙的转运障碍更为突出。从饱和状态下心肌最大的收缩力（Fmax）与细胞内钙关系来看3组间达到50％F_max时细胞内钙含量没有显著差异（0.47umol／L）（p＜0.05）。表明心力衰竭心肌收缩力下降与肌丝对钙的敏感性下降有关。3．梗塞后心衰组XO活性为5.53±0.41mU／mg蛋白，与对照组（2.92±0.29 mU／mg蛋白）有显著差异（p＜0.05）。氧化嘌呤酶明显抑制XO活性（2.63±0.27mU／mg蛋白）与梗塞后心衰组相比（抑制率达到50％以上），有显著差异（p＜0.05）。4．脂质过氧化产物MDA是自由基介导的损伤的指标之一。对照组，梗塞后心衰组，氧化嘌呤酶组生成的TBARS分别为0.57±0.05，1.23±0.09和0.71±0.06（nmol TBARS／mg蛋白）。梗塞后心衰组心肌组织中生成的TBARS明显高于对照组（p＜0.05）。氧化嘌呤酶明显减少了脂质过氧化产物MDA的生成，与梗塞后心衰组相比，有显著差异（p＜0.05）。5．OXYblot^TM蛋白氧化检测结果表明，梗塞后心衰心肌收缩蛋白成明显的氧化状态，氧化嘌呤酶可以抑制因梗塞引起心肌组织蛋白的氧化—肌动蛋白氧化修饰后蛋白羰基化。肌丝对钙敏感性的改变可能与心肌收缩蛋白氧化修饰、降解有关。讨论：本研究的主要特点是从分子水平灵敏、准确、动态地研究细胞内含量极微的细胞第二信使—钙在每一个心动周期中的微量变化，分析梗塞后心力衰竭心肌细胞内钙与心肌收缩力的关系，从而探讨梗塞后心力衰竭心肌发生异常兴奋收缩藕联的机制。本试验采用显微注射的方法将荧光指示剂fura-2直接注射到肌小梁单个细胞中，通过检测fura-2结合细胞内钙的荧光强度计算细胞内钙含量。采用双波长340／380nm分析荧光强度，可以更有效地克服背景误差，试验结果更可靠。该方法采用分离完整的肌肉作为研究对象，更接近生理状态，所得的结果更具有实用价值。该方法优于采用单个心肌细胞来研究细胞内钙含量和心肌收缩力的方法，因为单个心肌细胞要通过胰酶消化来分离，结果难免受到胰酶作用的干扰。由于注射到心肌细胞中的fura-2要通过心肌细胞的间隙连接均匀地扩散到整块肌肉中，而肌小梁比乳头肌细长且笔直，fura-2在肌小梁中扩散要比在乳头肌中扩散更均匀、更容易，因此，测定细胞内钙的结果更准确。但是分离肌小梁技术较分离乳头肌技术难度更高。均匀、细长且无分支的肌小梁来源比较少。特别是采用小鼠作为研究对象，试验难度进一步加大，但是有利于将来进一步做基因和分子生物学方面的深入研究。超声心动图的结果从整体水平证明氧化嘌呤酶能够改善心脏的射血功能。脂质过氧化产物、心肌收缩蛋白的氧化和黄嘌呤氧化酶活性的测定结果表明氧化应激与心力衰竭有密切关系，氧源自由基（OFR）参与了梗塞后心力衰竭的形成。心肌兴奋收缩藕联是指藕联心肌细胞电兴奋和心脏收缩泵出血液的中介过程。第二信使Ca²⁺对心肌细胞的电活动起至关重要的作用。在生理情况下，小量钙离子通过去激化激活的电压依赖性钙通道（VDLC）进入细胞内形成动作电位的平台并进一步触发肌浆网释放钙（钙诱导钙释放，通过肌浆网上ryanodine受体），使胞浆内游离钙升高。作为钙受体的肌钙蛋白结合了足够数量的钙并启动收缩机制。心肌舒张时，胞浆内钙浓度降低（胞浆内钙被转移到肌浆网储存起来，留备下一次收缩），使得钙与肌钙蛋白解离。心力衰竭时心肌表现出异常的兴奋收缩藕联现象。虽然多种因素可以导致心肌出现异常的兴奋收缩藕联，例如细胞凋亡、能量的耗竭、收缩蛋白的改变（氧化修饰，降解等）、肌桥动力学的异常等，但是心力衰竭心肌细胞钙调控能力下降是心肌收缩力降低和发生严重心律失常的最主要的原因。这主要表现在肌浆网中钙的负载下降。当肌浆网Ca-ATPase活性降低或者Ca-ATPase的功能表达下调时，肌浆网中钙的负载就会下降。另一个可使肌浆网钙中钙负载下降的原因是Na／Ca交换转运体NCX的表达升高。此外，肌浆网钙泵与舒张期肌浆网钙渗漏（即通过被磷酸化修饰后RyR2通道渗漏）之间的动态平衡遭到破坏，也可以使肌浆网钙中钙负载下降。当肌浆网钙中钙的储存耗竭时，钙释放就会减少。这些引起肌浆网钙中钙负载下降的因素，都可以引起钙瞬变的幅度降低，最终导致收缩力降低。梗塞后心肌的收缩力和细胞内钙均较正常对照组有显著下降。氧化嘌呤酶的抗氧化治疗能够使肌浆网钙中钙负载下降的情况得到改善，进而改善心衰心肌钙分布的不平衡状态，使细胞内钙水平恢复接近正常水平，从而协调力与钙的关系，增加心肌的收缩力。心力衰竭心肌收缩力降低的另一主要原因是肌丝敏感性的降低，这一点已被一些学者证明。从本试验的研究结果可以看出在ryanodine作用下，饱和状态下心力衰竭心肌达到50％Fmax时细胞内钙含量与正常对照组没有显著差异，表明心力衰竭心肌收缩力下降与肌丝对钙的敏感性下降有关。另外，肌动蛋白氧化也会降低肌丝对钙的敏感性。氧化嘌呤酶具有增加肌丝对钙敏感性的作用。传统的抗心衰药物，如强心甙类（通过抑制Na-K ATP ase，），β-肾上腺受体激动剂（通过蛋白激酶A磷酸化途径，增加CAMP浓度）和磷酸二酯酶抑制剂（通过抑制磷酸二酯酶活性，减少CAMP降解），它们共同和最终作用环节是通过非特异地增加心肌兴奋收缩藕联增益（EC coupling gain），增加细胞钙浓度而发挥强心作用的。因而不可避免地引起胞内Ca²⁺过多而继发心律失常、细胞损伤甚至坏死。氧化嘌呤酶作为2型钙敏化剂具有其独特的优点：氧化嘌呤酶只增加心肌收缩力，并不增加舒张力。它不引起细胞内的钙超载，不增加心肌耗氧，也不会抗心衰药物具有致心律失常的副作用。氧化嘌呤酶作为钙的增敏剂可能是通过增加收缩系统钙敏感性来发挥强心效应的。结论：本文从生物化学、酶学以及分子生物学多个角度研究了黄嘌呤氧化酶体系介导的氧源自由基与梗塞后心力衰竭的关系，充分论证了氧化应激参与了梗塞后心力衰竭的形成。氧化嘌呤酶能够抑制黄嘌呤氧化酶活性，减轻氧源自由基介导的脂质过氧化损伤，减弱心力衰竭心肌肌动蛋白羰基的氧化。氧化嘌呤酶能够有效抑制氧化应激。电生理实验表明梗塞后心力衰竭心肌细胞存在钙调控能力、钙瞬变的幅度和肌丝对钙的敏感性的异常。这些异常都会影响心肌收缩的强度。氧化嘌呤酶不但可以改善心肌细胞钙的调控能力，而且能够增加肌丝对钙的敏感性，从而发挥增强心肌的收缩力的作用。长期口服氧化嘌呤酶治疗心衰既有效，又安全（氧化嘌呤酶作为抗痛风的药物用于临床已多年）。关于氧化嘌呤酶改善心衰机制的研究还有待进一步深入。本文是作者在约翰霍普金森大学医学院心脏分子实验室从事博士后研究的工作的一部分。该课题受到美国健康研究院NIH（National Institute of Health）的资助（项目号：R01-HL-44065）。