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组织滴虫病(Histomoniasis)又称“盲肠肝炎”或“黑头病”,是由火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis,H.meleagridis)引起的鸡形目禽类的一种原虫病,以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征。化学药物在该病的控制上曾发挥过巨大作用,近年来因其潜在的毒性和致癌性大多已被禁用,导致该病不断流行和传播,给养禽业造成了严重的危害。火鸡组织滴虫激发的免疫反应以细胞免疫为主,本研究围绕虫株传代致弱活疫苗的创制开展了系列工作,初步研制出安全、有效的传代致弱活疫苗,有望为该病的控制提供安全、高效、方便的新手段。1.不同代次火鸡组织滴虫的致弱效果评价将分离的鸡源火鸡组织滴虫JSYZ-A株体外连续传代培养致弱,以不同代次(59、163、250)传代虫株泄殖腔感染15 d的京海黄鸡,感染后20 d全部扑杀,以发病率、死亡率、增重、脏器病变计分、脏器虫体DNA PCR检出率为指标,比较不同代次的火鸡组织滴虫致弱效果。结果显示:鸡群发病率随体外传代代次的增加而逐渐降低,增重则逐渐改善,A250代相对增重率最高,达到88.42%;A250代肝脏病变计分为0,与未感染阴性对照组无明显差异(p>0.05),明显低于强毒组和A59代(p<0.05);A250、A163、A59代盲肠计分差异不显著,A250与阴性对照组之间盲肠计分差异不显著,与强毒组差异极显著(p<0.01);肝脏与盲肠的病变计分均随着传代次数的增加而逐渐降低;PCR检测结果证实致弱虫株在靶器官内复制不受明显影响。结果表明,体外连续传代培养可降低火鸡组织滴虫致病力,致病力随代次增加而逐渐降低,A250代已经基本完全致弱且安全,为下一步开展致弱株的免疫保护效果研究奠定了基础。2.火鸡组织滴虫传代致弱株的免疫保护效果初探为初步了解致弱虫株有无免疫保护效果,将致弱株A163代泄殖腔接种15d的京海黄鸡,接种15d后以强毒株经泄殖腔感染攻虫,同时设立未免疫的强毒感染的阳性对照和未免疫未感染的阴性对照,20d后全部扑杀,以发病率、死亡率、增重、脏器病变计分为评价指标,初步评价致弱株的免疫保护效果。结果显示:免疫组较阳性对照组发病率下降40%,症状较为轻微;免疫组相对增重率为88.57%,高于阳性对照组的62.46%,相对增重改善明显(p<0.05),与阴性对照组无显著差异(p>0.05);免疫组肝脏损伤比阳性对照组轻微,病变计分下降低近50%,与阴性对照差异不显著(p<0.05);盲肠损伤比阳性对照组同样轻微,盲肠损伤鸡数下降40%,平均病变计分下降明显(p<0.05),但与阴性对照相比差异还是明显(p<0.05)。结果表明,随着传代增加,虫株致病力的逐渐下降的同时,163代虫株对鸡群已经具有一定的免疫保护效果,后续可以采用更高代次的致弱虫株用于活疫苗的进一步研制。.3.火鸡组织滴虫传代致弱株最适免疫剂量确定为探索致弱虫株的最佳免疫剂量,将A250虫株通过泄殖腔免疫15d京海黄鸡,30d时采用强毒虫株攻虫,15d后扑杀,以发病率、死亡率、增重、脏器病变计分为指标,比较了高中低三组(2×105个/羽、105个/羽、5×104个/羽)免疫剂量的免疫效果。结果显示:攻虫后鸡群发病率从高到低依次为强毒对照组、低免组、中免组、高免组和阴性对照组,高免组发病率11.11%,远远低于强毒组的88.89%;免疫三组组间增重差异不显著(p>0.05),均明显高于强毒对照组(p<0.05),且高免组与阴性对照组最为接近,相对增重率达91.08%;低免、中免、高免和阴性对照组四组肝脏平均病变计分不存在显著性差异(p>0.05),与强毒组之间有显著性差异(p<0.05),免疫组中高免组平均病变计分最低,仅有0.11;就盲肠病变计分而言,高免组、中免组和阴性对照组之间无显著性差异(p>0.05),高免组、低免组和强毒组之间存在显著性差异(P<0.05),免疫组中高免组平均病变计分最低。强毒组与其余各组之间均存在显著性差异(p>0.05),其中强毒与对照之间差异极显著(p<0.01)。结果表明,高剂量疫苗免疫保护效果最好,考虑到疫苗的总体积和雏鸡泄殖腔的承受能力,临床上推荐2×105个/羽的免疫剂量,未进行更高的免疫剂量的效果验证。4.火鸡组织滴虫传代致弱株最佳免疫程序研究为探索致弱虫株的最佳免疫程序,进行两次试验:试验一设3和9 d两次免疫、3 d单次免疫,试验二设3和15 d两次免疫、15 d单次免疫,两次试验均同时设立未免疫强毒对照组和未免疫未感染阴性对照组,强毒攻虫均在二次免疫后15d进行,两次试验分别在攻虫后18和24d扑杀,以发病率、死亡率、增重、脏器病变计分为指标,评价免疫效果。结果显示:二免组发病率明显低于一免组,增重效果略优于一免组,靶器官的损伤低于一免组,增加免疫次数能有效增强和改善致弱虫株的免疫保护效果。两次试验的发病率、增重、脏器病变计分等指标相比而言,3 d首免、15 d二免组的保护效果要稍优于3d首免、9d二免组。结果表明,3d首免、15d二免为最佳的免疫程序,推荐该程序作为田间推广应用的合适免疫程序。以上研究结果表明,本研究获得的鸡源火鸡组织滴虫传代致弱虫株致弱及免疫保护效果确实,有望成为控制组织滴虫病的绿色、安全的新手段,对于养禽业的稳步发展和保障人类健康均具有一定的意义。