研究背景食管鳞癌的发生是由多因素、多基因相互作用,并且在多阶段发挥作用的极为复杂的生物学过程,目前对其发生与发展的机理制尚未研究清楚,在诊断和治疗上也缺乏有效的手段。因此,深入研究食管鳞癌的发病机制并寻找新的肿瘤标志物和治疗靶标,具有十分重要的意义。近年来研究发现,信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生与发展。STAT3是信号转导和转录激活因子家族(STAT)的重要成员,表现尤为活跃。STAT3信号通路与细胞的生长、增殖及凋亡的关系十分密切,该通路的持续激活可以导致细胞异常增殖与恶性转化,与肿瘤的发生、发展密切相关,目前已将STAT3定义为癌基因。STAT3在接受非受体酪氨酸激酶、细胞因子以及生长因子等细胞外信号刺激后被磷酸化激活,形成磷酸化的STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3), p-STAT3会迅速移至细胞核内,与靶基因的启动子相结合,激活靶基因的转录,进而影响细胞的生长、增殖与凋亡。在正常生理情况下,STAT3的激活只是暂时的,在STAT3完成特定的信号传递后,会被去磷酸化,并重新回到细胞质中。而在各种致癌信号的刺激下,STAT3将会被持续激活,以活化的状态恒定地存于细胞核中,激活并调控诸如VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1等靶基因的转录,促进肿瘤细胞的增殖与浸润转移,与肿瘤的发生、发展密切相关。已有较多文献报道STAT3信号在多种恶性肿瘤中存在异常表达,阻断STAT3信号可以诱导肿瘤细胞凋亡,使肿瘤的生长受抑。随着对STAT3信号通路的深入研究,STAT3在肿瘤发生发展过程中所起的作用越来越受到重视,以STAT3为靶点的治疗方法有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟新的途径。食管鳞癌中是否存在STAT3信号转导通路,激活状态的STAT3是否参与了食管鳞癌的发生与发展,至今在国内外的文献报道较少。本课题通过应用逆转录-聚合酶链反应、免疫组织化学及Western免疫印迹等技术探讨了STAT3信号及其靶基因VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1与食管鳞癌临床病理特征之间的关系；探讨了食管鳞癌组织中STAT3与上述靶基因之间的相关性；并结合食管鳞癌患者的随访资料,探讨了STAT3及其靶基因与食管鳞癌的预后关系,以求从分子到蛋白水平多角度探讨STAT3信号通路在食管鳞癌发生与发展、浸润与转移中的作用机制,为食管癌的基因治疗筛选理想的靶标提供理论基础。第一部分食管鳞癌组织中STAT3信号的表达与临床病理特征之间的关系目的：研究食管鳞癌组织中STAT3及P-STAT3的表达与临床病理特征之间的关系,探讨其在食管癌变中的可能作用机制。方法：本研究选取2008年9月至2009年1月之间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除加系统淋巴结清扫的71例食管鳞癌患者的标本,包括71例食管鳞癌组织和20例随机选取的癌旁正常食管组织。应用RT-PCR技术检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织STAT3mRNA的表达情况；应用免疫组化与Western blot方法检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织中STAT3蛋白及P-STAT3蛋白的表达情况。应用SPSS13.0统计分析软件,将患者的临床资料、病理学特征以及实验结果共同建立数据库。计数资料采用χ2检验或Fisher’s精确概率检验法；计量资料应用均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较时采用独立样本t检验(方差齐时)或t’检验(方差不齐时),多组计量资料样本比较应用方差分析(F检验),若差别有统计学意义,则行SNK检验(q检验)进行两两比较,P<0.05为具有统计学意义。结果：RT-PCR结果显示,食管鳞癌组织中STAT3mRNA的表达均显著高于癌旁正常食管组织(80.3%：55%,P<0.05),STAT3mRNA的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)与pTNM分期均显著相关(P<0.05,P<0.05),STAT3mRNA阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深、pTNM分期的加重显著增高。免疫组化法检测STAT3蛋白的阳性表现为细胞浆和/或细胞核内出现棕黄色颗粒。食管鳞癌组织中STAT3蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常食管粘膜组织中STAT3蛋白的阳性表达率(83.1%：50.0%,P<0.01)。STAT3蛋白的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)及pTNM分期均显著相关(P<0.01, P<0.01), STAT3蛋白的阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深、随pTNM分期的加重显著增高。P-STAT3蛋白的阳性表现为细胞核内出现棕黄色颗粒。食管鳞癌组织中P-STAT3的阳性表达率显著高于癌旁正常食管组织中P-STAT3蛋白的阳性表达率(62.0%：15.0%,P<0.01)。P-STAT3蛋白的表达率随癌细胞浸润深度加深显著增高,与患者肿瘤的浸润程度(pT)显著相关(P<0.05)。在26例有淋巴结转移的食管鳞癌组织中,有22例(84.6%)P-STAT3蛋白表达阳性；在45例没有淋巴结转移的食管鳞癌组织中,有22例(48.9%)P-STAT3蛋白表达阳性,二者有显著性差异(P<0.01)。p-STAT3蛋白阳性表达率随pTNM分期的加重显著增高(P<0.05)。Western blot显示食管鳞癌组织中STAT3及P-STAT3蛋白水平均显著高于癌旁正常食管组织(P<0.01,p<0.01)。STAT3蛋白水平与患者肿瘤的浸润程度(pT)及pTNM分期显著相关(P<0.01,P<0.01), STAT3的蛋白水平随肿瘤浸润深度的加深、随pTNM分期的加重均显著增高。P-STAT3蛋白水平随癌细胞浸润深度加深显著增高,与患者肿瘤的浸润程度(pT)显著相关(P<0.01)。有淋巴结转移的食管鳞癌组织中P-STAT3蛋白水平显著高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织中P-STAT3蛋白水平(P<0.01)。P-STAT3表达率随pTNM分期的加重显著增高(P<0.01)。结论：食管鳞癌中存在着高表达的STAT3及P-STAT3;食管鳞癌组织中STAT3的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)及pTNM分期显著相关,P-STAT3蛋白的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移及pTNM分期显著相关,STAT3参与了食管鳞癌的发生、发展,激活的STAT3在食管鳞癌的浸润转移中起着一定的作用。第二部分食管鳞癌组织中STAT3信号与靶基因VEGF、cyclinD1、 Bcl-xL及MUC1关系的研究目的：探讨食管鳞癌组织中STAT3、p-STAT3与靶基因VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1的关系。方法：本研究选取2008年9月至2009年1月之间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除加系统淋巴结清扫的71例食管癌患者的标本,包括71例食管鳞癌组织和20例随机选取的癌旁正常食管组织。分别应用RT-PCR技术和免疫组化技术检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织STAT3、VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1的表达情况；应用免疫组化技术检测食管鳞癌组织及其相应的癌旁正常食管组织中P-STAT3的表达情况。应用SPSS13.0统计分析软件,将患者的临床资料、病理学特征以及实验结果共同建立数据库。应用χ2检验或Fisher’s精确概率检验法比较STAT3、 p-STAT3、VEGF、cyclinD1、Bcl-xL以及MUC1在各组标本中表达的差异情况,各因子之间相关性分析采用Spearman等级法,P<0.05为具有统计学意义。结果：RT-PCR结果显示,食管鳞癌组织中VEGF mRNA、cyclinDl mRNA、Bcl-xL mRNA及MUC1mRNA的表达均显著高于癌旁正常食管组织(P<0.01,P<0.01,P<0.01, P<0.01)。VEGF mRNA的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移及pTNM分期显著相关(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。VEGF mRNA阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深、随pTNM分期的加重显著增高。VEGF mRNA在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(88.5%：48.9%,P<0.01)。cyclinD1mRNA在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(80.8%：48.9%,P<0.05)。Bcl-xL mRNA的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)显著相关(P<0.05), Bcl-xL mRNA阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深显著增高。MUC1mRNA的表达率与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移显著相关(P<0.05,P<0.05)。MUC1mRNA阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深显著增高,MUC1mRNA在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(84.8%：37.8%,P<0.05)。免疫组化结果显示,VEGF蛋白阳性细胞表现为细胞浆出现棕黄色颗粒,cyclinDl蛋白阳性细胞表现为细胞核内出现棕黄色颗粒,Bcl-xL蛋白阳性细胞表现为细胞浆出现棕黄色颗粒,MUC1蛋白阳性细胞表现为细胞浆出现棕黄色颗粒。食管鳞癌组织中VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1蛋白的表达均显著高于癌旁正常食管组织(P<0.01, P<0.01, P<0.01, P<0.01)。VEGF的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移及pTNM分期显著相关(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。VEGF蛋白阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深、随pTNM分期的加重显著增高。VEGF蛋白在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(84.6%：44.4%%,P<0.05)。cyclinD1蛋白的表达与患者肿瘤的淋巴结转移显著相关(P<0.05),cyclinD1蛋白在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(76.9%:44.4%,p<0.05)。Bcl-xL蛋白的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)显著相关(P<0.05), Bcl-xL蛋白阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深显著增高。MUCl蛋白的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移显著相关(P<0.05,P<0.05)。MUC1蛋白阳性表达率随肿瘤浸润深度的加深显著增高(P<0.05),MUC1蛋白在有淋巴结转移的食管鳞癌组中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(80.9%：55.6%,P<0.05)。Spearman等级相关分析表明,在食管鳞癌组织中STAT3mRNA表达与VEGF mRNA表达呈显著正相关(r=0.285,P<0.05)。STAT3蛋白表达与P-STAT3蛋白表达呈显著正相关(r=0.421,P<0.01),与VEGF蛋白表达呈显著正相关(r=0.255,P<0.05)。P-STAT3蛋白表达与VEGF蛋白表达呈显著正相关(r=0.352,P<0.01),与cyclinD1蛋白表达呈显著正相关(r=0.305,P<0.05),与MUC1蛋白表达呈显著正相关(r=0.273,P<0.05),与Bcl-xL蛋白表达无显著相关。结论：VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1在食管鳞癌中都存在明显的高表达。VEGF的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移及pTNM分期显著相关；cyclinD1的表达与患者肿瘤的淋巴结转移显著相关；Bcl-xL的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)显著相关；MUC1的表达与患者肿瘤的浸润程度(pT)、淋巴结转移显著相关。食管鳞癌组织中STAT3与VEGF的表达呈显著正相关,P-STAT3与VEGF、cyclinD1、及MUC1的表达均呈显著正相关。由此推测,激活的STAT3可能通过促进靶基因VEGF、cyclinDl以及MUC1的表达,进而促进食管鳞癌的浸润和转移；STAT3可能直接促进VEGF的表达,对食管鳞癌的发生、发展产生影响。第三部分STAT3信号及其靶基因VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1与食管鳞癌预后的关系目的：探讨STAT3、p-STAT3及其靶基因VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUC1与食管鳞癌预后的关系。方法：本研究选取2008年9月至2009年1月之间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除加系统淋巴结清扫的71例食管鳞癌患者的标本,包括71例食管鳞癌组织和20例随机选取的癌旁正常食管组织。应用RT-PCR技术和免疫组化技术检测食管鳞癌组织STAT3、VEGF、cyclinD1、Bcl-xL及MUCl的表达情况；应用免疫组化技术检测食管鳞癌组织中P-STAT3的表达情况。并对患者出院后进行跟踪随访,应用SPSS13.0软件进行统计分析,Kaplan-Meier法计算生存率,Log-rank检验比较生存率差别,应用Cox回归分析判定手术后生存率的预后因素。P<0.05表示有统计学意义。结果：Kaplan-Meier生存曲线分析显示本组食管鳞癌患者3年生存率是52.1%。肿瘤浸润深度(pT)不同组别3年生存率分别为：pTl组100%,pT2组63%,pT3组19%：经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P<0.01)。淋巴结转移阳性组患者的3年生存率显著低于淋巴结转移阴性组患者的3年生存率(7.7%：77.8%,P<0.01)。而pTNM分期不同组别3年生存率分别为：pⅠ组100%,pⅡ组58.2%,pⅢ组8.3%。经Log-Rank检验总体间差别具有统计学意义(P<0.01)。而患者的性别、年龄、肿瘤长度、肿瘤位置以及分化程度均与患者的3年生存率无关。STAT3mRNA及蛋白阳性组患者3年生存率分别为49.1%、49.2%,虽然低于STAT3mRNA及蛋白阴性组患者3年生存率的64.3%和66.7%,经Log-Rank检验分析,总体间差别无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。VEGFmRNA表达阳性组患者的3年生存率显著低于VEGFmRNA表达阴性组患者的3年生存率(35.6%：80.8%,P<0.01)；VEGF蛋白表达阳性组患者的3年生存率同样显著低于VEGF蛋白表达阴性组患者的3年生存率(35.7%：75.9%,P<0.01)。cyclinDlmRNA表达阳性组患者的3年生存率显著低于cyclinDlmRNA表达阴性组患者的3年生存率(41.9%：67.9%,P<0.05)；cyclinD1蛋白表达阳性组患者的3年生存率同样显著低于cyclinD1蛋白表达阴性组患者的3年生存率(40.0%：67.7%,P<0.05)。Bcl-xLmRNA及蛋白阳性组患者3年生存率分别为51.0%、47.8%,虽然低于Bcl-xLmRNA及蛋白阴性组患者3年生存率54.5%和60.0%, Log-Rank检验总体间差别无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。MUC1mRNA表达阳性组患者的3年生存率显著低于MUC1mRNA表达阴性组患者的3年生存率(41.7%：73.9%,P<0.05)；MUC1蛋白表达阳性组患者的3年生存率同样显著低于MUC1蛋白表达阴性组患者的3年生存率(41.3%：72.0%,P<0.05)。P-STAT3蛋白表达阳性组患者的3年生存率显著低于P-STAT3蛋白表达阴性组患者的3年生存率(34.1%:81.5%, P<0.01).Cox多因素回归分析结果显示：肿瘤的浸润深度(pT)和淋巴结转移是患者食管鳞癌患者手术后3年生存率的独立危险因素结论：肿瘤浸润深度(pT)、淋巴结转移、pTNM分期、P-STAT3、VEGF、cyclinD1、 MUC1是影响食管鳞癌患者3年生存率的相关因素。肿瘤的浸润深度(pT)和淋巴结转移是患者食管鳞癌患者手术后3年生存率的独立危险因素。