多发性骨髓瘤（MM）是恶性浆细胞病中最常见的一种类型，以单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征，从而引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高黏滞综合征、肾功能不全等一系列临床表现并导致不良后果。MM是继非霍奇金淋巴瘤之后的第二种常见血液系统恶性疾病，其发病在所有恶性肿瘤中占1％，在恶性血液疾病中占10%。随着免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂等新药的产生，MM患者获得更大程度的缓解，有效的延长了患者生存期，但疾病最终仍会复发。到目前为止，MM依然不可治愈，第一次复发后其中位生存期仅为17个月，五年的生存率仅达38%。故寻求治疗新药及制定新的化疗方案，延长患者的总生存期，改善终末期患者的生活质量，依然是血液科医师治疗MM时面临的挑战。　　研究发现，血管新生既能为肿瘤的生长、转移提供营养支持，参与代谢产物的运送，通过旁分泌的生理性刺激促进肿瘤生长，又可以作为肿瘤细胞血液转移的通路，帮助肿瘤的组织及器官侵润和转移，是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件之一。Vacca等首次发现，MM患者骨髓内血管新生现象更为严重，可间接提示疾病进展及不良预后，这佐证了血管新生可能是 MM发病机制中的重要病理机制之一。　　机体血管中成熟内皮细胞（EC）和骨髓或循环系统中内皮细胞的前体细胞，即内皮祖细胞（EPCs）是MM中的新血管形成的两大来源。EPC可以摄取乙酰化低密度脂蛋白，具有von Willebrand因子（vWF），在体外培养中具有特异的形态特征，其表面既表达造血干细胞（HSC）表面标志，如CD34、CD133，又表达EC表面标志，如血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）。目前倾向将CD34﹢、VEGFR2/KDR﹢、CD133﹢的细胞视为EPCs。鉴于EPCs在新生血管形成中所占的重要地位，将EPCs作为观察MM新生血管生成过程中的切入点。　　重组人血管内皮抑素（rhES）是一种高效、广覆盖地抑制血管生成的分子靶向新药，其广谱的抗肿瘤活性，主要通过抑制非生理性血管生成、肿瘤增殖和转移的途径发挥。重组人血管内皮抑素注射液（代号YH216,商品名:恩度）是由我国学者独立研制的一种新型人血管内皮抑素，作为抗肿瘤血管生成药物，中国版NCCN指南已连续6年将其联合一线化疗方案作为NSCLC的推荐治疗。随后，许多学者在rhES对其他恶性肿瘤的研究报道，均证实了其明显的抑制血管新生的作用。故推测rhES对MM患者的EPCs的生物学功能也会有一定程度的影响，但究竟通过何种途径产生影响？体外实验和体内实验结果基本符合吗？这些问题仍不清楚。　　结合以上思考，本课题分为两部分展开，第一部分，将rhES联合国际通用MM化疗方法进行观察，并以联合沙利度胺（Tha）治疗为对照组，探讨MM患者复发治疗的新策略，观察rhES治疗的有效性和可行性；第二部分，体外检测MM患者骨髓来源EPCs的生物学功能、rhES对EPCs的影响，初步探讨rhES对抗MM血管新生的部分作用机制。　　第一部分RhES在复发难治性多发性骨髓瘤中的疗效观察　　目的:观察rhES联合VD案、常规方案（VCMP方案、VAD方案、MP方案）治疗复发难治性MM（RRMM）患者的临床疗效及安全性。　　方法:回顾性分析25名接受 rhES联合 VD方案、22名接受 VD联合沙利度胺（VTD）方案、32名接受 rhES联合常规方案、32名接受常规方案联合沙利度胺（Tha）患者的临床资料，比较VD方案组间、常规方案组间患者的总反应率（ORR）、无进展生存（PFS）、总生存（OS）及不良反应发生率的差异。并观察患者接受rhES治疗后骨髓中CD31+细胞的变化。　　结果:RhES联合VD组、VTD组的ORR分别为76%（19/25）、59%（13/22），差异无统计学意义。rhES联合常规方案组、常规联合Tha方案组的ORR分别为44%（14/32）、34%（11/32），差异无统计学意义。截止2014年9月1日，21例死亡，3例失访，中位随访时间7.5（0.4～27.6）月。rhES联合VD组中位PFS和中位OS分别为6.9（0.5～17.3）月、15.7（0.5～27.6）月，VTD组中位PFS和中位OS分别为5.2（0.5～14.6）月、13.4（0.5～24.9）月，两组PFS差异有统计学意义，而OS差异无统计学意义。rhES联合常规方案组中位PFS和中位OS分别为5.1（0.6～11.7）月、6.3（0.6～18.6）月，常规方案联合Tha组中位PFS和中位OS分别为2.7（0.4～8.0）月、3.4（0.4～15.7）月，两组PFS差异有统计学意义，OS差异无统计学意义。患者最常见的不良反应是骨髓抑制所致的感染和便秘，但组间差异无统计学意义。试验组患者骨髓活检中CD31+细胞较治疗前明显减少。　　小结:RhES可作为RRMM治疗方案的有效补充，延长PFS，改善患者的生活质量。　　第二部分RhES治疗多发性骨髓瘤作用机制的探讨　　目的:　　1、观察初治MM患者骨髓来源EPCs的生物学特性，以及新生血管的形成能力；　　2、探讨rhES对初治MM患者骨髓来源EPCs血管形成能力和蛋白表达影响的部分机制；　　3、验证 rhES对 MM细胞系 RPMI8226及健康成人骨髓单个核细胞（MNC）生长的抑制作用。　　方法:　　1、使用密度梯度离心法，分离初治MM患者骨髓来源的MNC，并诱导培养为EPCs，观察细胞的生物学特性；　　2、使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）和FITC标记的荆豆凝集素1（FITC-UEA-1）双荧光染色和流式细胞术检测细胞表面抗原 CD34、CDl33、VEGFR-2表达情况及matrigel凝胶成血管实验的方法对EPCs行进鉴定；　　3、不同浓度rhES（0～250μg/ml）加入matrigel后，观察matrigel凝胶中EPCs的新生血管的形成情况。用Western blot方法检测rhES对EPCs的vWF、VEGFR-2、TEK蛋白表达的影响；　　4、CCK-8方法检测不同浓度rhES（0～500μg/ml）对MM细胞株RPMI8226增殖的影响。使用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测RPMI8226细胞凋亡。观察不同浓度rhES（0～250μg/ml）作用下健康成人骨髓MNC的生长曲线。　　结果:　　1、分离MNC培养4天后细胞增殖速度加快，约第7天可出现明显的集落形成和条索状改变，第10天细胞间融合率约为80%；　　2、取第2代EPCs，经Dil-acLDL和FITC-UEA-1染色后，荧光显微镜下观察，可见双阳性标记黄色荧光细胞占90%以上。取第5代EPCs，流式细胞仪检测，其表面特异性抗原CD34、CD133、VEGFR-2含量分别为(36.78±0.14)％，(0.75±0.67)％，(46.87±0.96)％。取第2代EPCs，可观察到其可在Matrigel凝胶中形成管腔状状结构；　　3、RhES能抑制EPCs在matrigel凝胶中血管新生能力。在rhES作用下，EPCs细胞中细胞因子受体TEK、vWF以及VEGFR-2的表达均出现下调；　　4、RhES能抑制RPMI8226细胞株的生长，不能明显促进其凋亡；但不抑制健康成人骨髓MNC的生长。　　小结:　　1、RhES可显著抑制EPCs介导的血管新生，通过下调vWF、VEGFR-2、TEK的表达抑制EPCs向EC分化；　　2、RhES可抑制MM细胞生长，但对健康成人骨髓MNC无明显影响。　　结论:　　1、RhES可阻止EPCs向EC的分化，抑制新生血管形成。rhES可阻止MM细胞系的生长，但不影响健康成人骨髓MNC的生长活性；　　2、RhES可作为RRMM患者化疗方案的补充，延长无病生存期，且安全性高。