青虾(Macrobrachium nipponesis)是我国最重要的淡水经济虾类之一,因其具有高繁殖力,强适应性,杂食性,肉质鲜美,营养丰富,可常年上市等优点已成为水产养殖业发展的主导品种之一。但是,随着青虾养殖规模的扩大和水域生态环境的逐渐恶化,致病性微生物对青虾的危害也日趋严重,病害的发生已经严重制约了青虾养殖的健康可持续发展。2017年至2019年期间,江苏省扬州市部分青虾养殖场出现大规模死亡现象,发病青虾表现为体表及肝胰腺发红,活力减弱,食欲下降,对外界刺激反应迟钝,继而引起大批死亡。目前,有关这一疾病的爆发病因尚未有报道,针对这一疾病的发生,本研究鉴定了引起青虾发病的病原菌XL1,探究了病原菌的致病性及其引起的宿主免疫反应,并筛选出一株对病原菌具有良好抑菌效果的芽孢杆菌CPA1-1,从而为该疾病的防治建立一定的理论基础。1.从发病濒死的青虾肝胰腺中分离出优势菌株XL1,并对该菌的分类地位、致病性、毒力相关基因的携带、胞外酶的分泌以及感染青虾后的组织病理变化情况等方面进行研究。人工感染实验结果表明该菌株对青虾有较强的致病性,其半数致死浓度LD50为4.09×104CFU/mL。通过形态学和生理生化特征以及细菌16S rRNA和gyrB序列研究确定该分离菌株XL1为病原非O1霍乱弧菌(Non-O1 Vibrio cholerae)。PCR扩增结果表明该菌携带金属蛋白酶(Mp)、溶血素(HlyA)、粘附因子(RtxA)、外膜蛋白(OmpU)、辅助霍乱肠毒素(Ace)、小带联结毒素基因(Zot)和Ⅵ分泌系统(T6SS)等毒力基因。分离菌XL1胞外酶检测结果表明,该菌株具有淀粉酶、卵磷脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有脂肪酶和脲酶活性。组织病理学观察发病青虾肝胰腺中的肝小管腔及肝小管间间隙增大,刷状边界消失,青虾肝胰腺组织的损害可能是导致青虾死亡的主要原因。2.为研究青虾感染病原非O1霍乱弧菌后的免疫反应,本研究对致病菌XL1感染青虾6 h和12 h后的肝胰腺进行了高通量测序。结果表明在6 h时共有189个差异表达基因,其中包括104上调基因和85个下调基因。在12h时总共有56个差异表达基因,其中包括39个上调基因和17个下调基因,且在6h时免疫相关基因表达明显上调的数量较12 h时多。此外,发现通过转录组分析得到的数据与荧光定量PCR试验得到的差异基因的表达情况基本一致,这也说明了我们转录组分析结果具有可靠性。病原非O1霍乱弧菌感染青虾后,与Rap1信号通路、MAPK信号通路、ECM-受体相互作用、胞吞作用、Hippo信号通路、泛素介导的蛋白水解和吞噬体相关的基因都表现出明显变化,表明这些信号通路均被激活。本研究获得的数据为进一步的研究免疫应答提供了有价值的数据资源。为进一步研究非O1霍乱弧菌感染后青虾血淋巴中免疫相关基因差异表达,本研究采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了青虾感染致病菌XL1后13个免疫相关基因在不同时间点的mRNA表达水平,结果表明青虾血淋巴中的dorsal,relish,p38,crustin1,crustin2,crustin3,hemocyanin,i-lysozyme,anti-lipopolysaccharidefac-tors 1,anti-lipopolysaccharide factors 2,prophenoloxidase免疫相关基因的表达水平显著上调。这些结果揭示了免疫相关基因在青虾血淋巴中的表达谱的变化和转录激活,有助于更好地了解病原非O1型霍乱弧菌入侵的发病机制和宿主防御系统。3.为研究芽孢杆菌对青虾的益生机理,本研究采用双层平板法从健康的青虾体内分离出一株具有明显拮抗作用的菌株CPA1-1。通过形态学、生理生化特征以及16SrRNA和gyrB序列分析,最终确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。并对该菌株的生长特性、抑菌效果及携带抗生素相关基因情况等方面进行研究,结果表明:菌株CPA1-1对非O1霍乱弧菌的最小抑菌浓度为2.7×105CFU/mL,且该菌株携带srfAA、ituA、fenA、dhbA、bmyA、beaS、dfnA等脂肽类、聚酮类化合物以及抗菌蛋白的合成相关基因。此外,研究了养殖水体中添加不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌发酵液对青虾肝胰腺和血淋巴中免疫相关基因和酶活的影响。结果表明水体中添加益生菌能调节免疫相关基因的表达水平和免疫相关酶活活性,降低水中氨氮和亚硝酸氮含量。攻毒实验结果表明水体中添加贝莱斯芽孢杆菌CPA1-1可以增强青虾抗病原非O1霍乱弧菌感染的能力,提高青虾成活率。本研究为芽孢杆菌在青虾养殖中的合理使用提供一定的理论依据。